Иммуномодуляторлӑ метаболитсем — шыҫӑ микротавралӑхӗн (ТМТ) тӗп палли, анчах та, хӑш-пӗр тӗслӗхсемсӗр пуҫне, вӗсен пӗрпеклӗхӗсем нумайӑшӗ паллӑ мар. Кунта эпир ҫак тӗрлӗ ТМЭ компартменчӗсен метаболомине уҫса пама пысӑк степеньлӗ серозлӑ карциномӑпа (ПСК) чирлекенсен шыҫҫисемпе асцитӗсенчи шыҫӑсемпе Т-клеткӑсене анализларӑмӑр. Асцитпа шыҫӑ клеткисен метаболит уйрӑмлӑхӗсем пысӑк. Асцитпа танлаштарсан, шыҫӑна кӗрекен Т-клеткӑсем 1-метилникотинамидпа (МНА) палӑрмаллах пуянланнӑ. Т-клеткӑсенчи МНА шайӗ ӳснӗ пулин те, никотинамид N-метилтрансферазӑн (S-аденозилметионинран никотинамида метил ушкӑнӗсене куҫарассине катализлакан фермент) экспрессийӗ фибробластсемпе шыҫӑ клеткисемпе ҫеҫ чикӗленет. Функци тӗлӗшӗнчен илсен, МНА Т-клеткӑсене шыҫӑ аталанӑвне аталантаракан цитокин шыҫӑ некрозӗн альфа факторне секретлама хистет. Ҫавӑнпа та ТМЭ-ран илнӗ МНА Т-клеткӑсен иммунлӑ регуляцине пулӑшать тата этем ракне сиплемелли иммунотерапин потенциаллӑ тӗллевӗ пулса тӑрать.
Шыҫӑран пулакан метаболитсем шыҫӑна хирӗҫ кӗрешекен иммунитета тарӑн чарса тӑракан витӗм кӳме пултараҫҫӗ, ҫавӑнпа та вӗсем чир аталанӑвӗн тӗп хӑватӗ пулма пултарнине кӑтартакан ҫирӗплетӳсем ытларах та ытларах пулаҫҫӗ (1). Варбург эффектӗсӗр пуҫне, юлашки вӑхӑтра шыҫӑ клеткисен ылмашӑну тӑрӑмне тата унӑн шыҫӑ микротавралӑхӗн (ТМТ) иммун тӑрӑмӗпе ҫыхӑнӑвне палӑртма пуҫланӑ. Шӑшисен моделӗсемпе тата этем Т-клеткисемпе тунӑ тӗпчевсем ҫакна кӑтартнӑ: глутамин ылмашӑнӑвӗ (2), оксидациллӗ ылмашӑнӑвӗ (3) тата глюкоза ылмашӑнӑвӗ (4) тӗрлӗ иммун клеткисен ушкӑнӗсем ҫинче хӑйсем тӗллӗн ӗҫлеме пултараҫҫӗ. Ҫак ҫулсенчи темиҫе метаболит Т-клеткӑсен шыҫӑна хирӗҫле ӗҫне чакарать. Тетрагидробиоптерин (BH4) кофермент блокади Т-клеткӑсен пролиферацине сиенлеме пултарнине, организмра BH4 ӳсни CD4 тата CD8 урлӑ шыҫӑна хирӗҫле иммунлӑ хурав вӑйлатма пултарнине ҫирӗплетнӗ. Унсӑр пуҫне, кинуренинӑн иммуносупрессивлӑ витӗмне BH4 (5) ӗҫтернипе ҫӑлса хӑварма пулать. Изоцитратдегидрогеназа (IDH) мутантлӑ глиобластомӑра энантиометаболизмлӑ (R)-2-гидроксиглутарат (R-2-HG) секрецийӗ Т-клеткӑсен активацине, пролиферацине тата цитолиз ӗҫне чакарать (6). Юлашки вӑхӑтра метилглиоксал, гликолизӑн ҫумпродукчӗ, миелоидлӑ супрессор клеткисем туса кӑларнине кӑтартнӑ, метилглиоксалӑн Т-клеткӑсене куҫарни эффектор Т-клеткӑсен ӗҫне пӳлме пултарать. Сиплевре метилглиоксала нейтрализацилени миелоидран пулакан супрессор клеткисен (МДСК) ӗҫне ҫӗнтерме тата шӑши моделӗсенче тӗрӗслев пункчӗсен блокадӑллӑ терапине синергиллӗ майпа вӑйлатма пултарать (7). Ҫак тӗпчевсем пӗрле ТМЭ-ран илнӗ метаболитсен Т-клеткӑсен ӗҫне тата ӗҫне йӗркелесе тӑрас ӗҫре тӗп вырӑн йышӑннине палӑртаҫҫӗ.
Т-клеткӑсен ӗҫӗ пӑсӑлни ҫинчен ананас ракӗнче анлӑн пӗлтернӗ (8). Ку пӗр енчен гипоксипе тата шыҫӑ юн тымарӗсен йӗркесӗрлӗхӗпе ҫыхӑннӑ ылмашӑну характеристикисемпе ҫыхӑннӑ (9), ҫакӑ вара глюкозӑпа триптофана сӗт йӳҫекӗпе кинуренин пек ҫумпродуктсем туса хурать. Ытлашши клетка тулашӗнчи лактат интерферон-γ (IFN-γ) туса кӑларассине чакарать тата миелосупрессивлӑ подгруппӑсен дифференциацине хӑвалать (10, 11). Триптофан ҫини Т-клеткӑсен пролиферацине тӳрремӗнех чарать тата Т-клеткӑсен рецепторӗсен сигнализацине чарать (12-14). Ҫак сӑнавсене пӑхмасӑрах, иммун ылмашӑнӑвӗ тавра нумай ӗҫ in vitro Т-клеткӑсен культуринче оптимизациленӗ хатӗрсемпе усӑ курса туса пынӑ, е in vivo гомологлӑ шӑши моделӗсемпе ҫеҫ чикӗленнӗ, вӗсенчен нихӑшӗ те этем ракӗн гетерогенлӑхне тата физиологи макро тата микро тавралӑхне туллин кӑтартса памасть.
Яичниксен шыҫҫин пӗрлехи палли — вар-хырӑм сарӑлни тата асцит палӑрни. Асцитра клетка шӗвекӗ пухӑнни чир аталаннипе тата начар прогнозпа ҫыхӑннӑ (15). Пӗлтернӗ тӑрӑх, ҫак хӑйне евӗрлӗ уйрӑм гипоксиллӗ, унта юн тымарӗсен эндотелийӗн ӳсӗм факторӗ (VEGF) тата индоламин 2,3-диоксигеназа (IDO) пысӑк шайра, унта Т-регуляторлӑ клеткӑсемпе тата миелоид ингибиторлӑ клеткисемпе инфильтрациленнӗ (15-18). Асцитӑн метаболита хутлӑхӗ шыҫӑн хӑйӗннинчен урӑхларах пулма пултарать, ҫавӑнпа та перитонеаллӑ уҫлӑхри Т-клеткӑсен репрограммированийӗ паллӑ мар. Унсӑр пуҫне, шыҫӑ таврашӗнчи асцитпа метаболитсен хушшинчи тӗп уйрӑмлӑхсемпе гетерогенлӑх иммун клеткисен инфильтрацине тата вӗсен шыҫӑсем ҫинчи ӗҫне чӑрмантарма пултарать, ҫавӑнпа та малалла тӗпчевсем кирлӗ.
Ҫак ыйтусене татса парас тесе эпир тӗрлӗ клетка типӗсене (ҫав шутра CD4 + тата CD8 + Т-клеткӑсене) тата шыҫӑ ӑшӗнчи тата шыҫӑ хушшинчи клеткӑсене тӗпчеме сисӗмлӗ клеткӑсене уйӑрса илмелли тата шӗвек хроматографи тандемлӑ масс-спектрометри (LC-MS/MS) меслетне шутласа кӑлартӑмӑр. Ҫак меслетпе эпир пысӑк виҫеллӗ юхӑм цитометрипе тата пӗр клеткӑллӑ РНК секвенированийӗпе (scRNA-seq) пӗрле ҫак тӗп популяцисен ылмашӑну статусӗн пысӑк татӑклӑ портретне тума усӑ куратпӑр. Ку меслет шыҫӑ Т-клеткисенче 1-метилникотинамид (МНА) шайӗ палӑрмаллах ӳснине палӑртнӑ, in vitro экспериментсем вара МНА Т-клеткӑсен ӗҫӗ ҫине иммуномодуляторлӑ витӗм кӳни унччен паллӑ пулманнине кӑтартнӑ. Пӗтӗмӗшле илсен, ҫак меслет шыҫӑсемпе иммун клеткисем хушшинчи пӗр-пӗринпе ылмашӑнакан хутшӑнусене уҫса парать, иммун регуляцийӗн метаболичӗсем ҫинчен хӑйне евӗрлӗ ӑнланусем парать, вӗсем Т-клеткӑсем ҫинче никӗсленнӗ ҫӑмарта шыҫҫин иммунотерапийӗн сиплевӗнче усӑллӑ пулма пултараҫҫӗ.
Эпир пысӑк виҫеллӗ юхӑм цитометрипе усӑ курса глюкоза йышӑнӑвне пӗр вӑхӑтрах шутласа кӑлартӑмӑр [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-дезоксиглюкоза (2-NBDG) тата митохондри активлӑхне [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (MTDR, 2017) иммунлӑ клеткӑсемпе шыҫӑ клеткисен популяцийӗсене уйӑрса тӑракан типлӑ маркерсем (S2 табл. тата S1A ӳкерчӗк). Ҫак анализ ҫакна кӑтартнӑ: Т-клеткӑсемпе танлаштарсан, асцитпа шыҫӑ клеткисен глюкоза йышӑнӑвӗн шайӗ пысӑкрах, анчах митохондри ӗҫӗн уйрӑмлӑхӗсем пӗчӗкрех. Шыҫӑ клеткисен вӑтам глюкоза йышӑнӑвӗ [CD45-EpCAM (EpCAM)+] Т-клеткӑсенчен виҫӗ-тӑватӑ хут пысӑкрах, CD4 + Т-клеткӑсен вӑтам глюкоза йышӑнӑвӗ CD8 + Т-клеткӑсеннинчен 1,2 хут пысӑкрах, ку вара шыҫӑ инфильтрациллӗ лимфоцитсен (TIL) пӗр пек TAME ӳкерчӗкре те метаболита ыйтӑвӗсем тӗрлӗрен пулнине пӗлтерет (1-мӗш ӳкерчӗк). Унпа танлаштарсан, шыҫӑ клеткисенчи митохондри активлӑхӗ CD4 + Т-клеткӑсенни пекех, икӗ клетка типӗн те митохондри активлӑхӗ CD8 + Т-клеткӑсенчен пысӑкрах (1-мӗш ӳкерчӗк, В). Пӗтӗмӗшле илсен, ҫак кӑтартусем ылмашӑну шайне уҫса параҫҫӗ. Шыҫӑ клеткисен ылмашӑну ӗҫӗ CD4 + Т-клеткӑсенчен пысӑкрах, CD4 + Т-клеткӑсен ылмашӑну ӗҫӗ CD8 + Т-клеткӑсенчен пысӑкрах. Клеткӑсен тӗсӗсем хушшинче ҫак эффектсем пур пулин те, CD4 + тата CD8 + Т-клеткӑсен ылмашӑну статусӗнче е вӗсен асцитри шайлашӑвӗнче шыҫӑсемпе танлаштарсан пӗр пек уйрӑмлӑх ҫук (1С ӳкерчӗк). CD45-клетка фракцийӗнче вара шыҫӑри EpCAM+ клеткӑсен пайӗ асцитпа танлаштарсан ӳснӗ (1D ӳкерчӗк). Эпир ҫавӑн пекех EpCAM+ тата EpCAM- клетка компоненчӗсем хушшинчи ылмашӑну уйрӑмлӑхне те асӑрхарӑмӑр. EpCAM+ (шыҫӑ) клеткисен глюкозӑна йышӑнасси тата митохондри активлӑхӗ EpCAM- клеткисенчен пысӑкрах, ку вӑл TME-ри шыҫӑ клеткисенчи фибробластсен метаболита активлӑхӗнчен чылай пысӑкрах (1-мӗш ӳкерчӗк, Е тата F).
(А тата В) Глюкоза йышӑнӑвӗн вӑтам флуоресценци хӑватлӑхӗ (2-NBDG) (А) тата CD4 + Т-клеткӑсен митохондри активлӑхӗ (MitoTracker тӗксӗм хӗрлӗ) (В) Репрезентативлӑ графиксем (сулахайра) тата таблицӑллӑ даннӑйсем (сылтӑмра), CD8 + Т-клеткӑсем тата EpCAM + CD45-шыҫӑ клеткисем тата шыҫӑ клеткисем пек. (C) Асцитпа шыҫӑра CD4 + тата CD8 + клеткӑсен (CD3 + Т-клеткӑсен) шайлашӑвӗ. (D) Асцитпа шыҫӑра EpCAM + шыҫӑ клеткисен пайӗ (CD45−). (E тата F) EpCAM + CD45-шыҫӑ тата EpCAM-CD45-матрица глюкоза йышӑнӑвӗ (2-NBDG) (E) тата митохондри активлӑхӗ (MitoTracker тӗксӗм хӗрлӗ) (F) представительлӗ графиксем (сулахайра) тата таблицӑллӑ даннӑйсем (сылтӑмра) Асцит тата шыҫӑ клеткисем. (G) CD25, CD137 тата PD1 экспрессийӗн репрезентативлӑ графикӗсем юхӑм цитометрипе. (H тата I) CD25, CD137 тата PD1 экспрессийӗ CD4 + Т-клеткӑсем ҫинче (H) тата CD8 + Т-клеткӑсем ҫинче (I). (J тата K) CCR7 тата CD45RO экспрессийӗ ҫинче никӗсленнӗ наивлӑ, тӗп астӑвӑм (Tcm), эффектор (Teff) тата эффектор астӑвӑмӗ (Tem) фенотипӗсем. Асцитпа шыҫӑсенче CD4 + Т-клеткӑсен (J) тата CD8 + Т-клеткӑсен (K) репрезентативлӑ ӳкерчӗкӗсем (сулахайра) тата таблицӑллӑ даннӑйсем (сылтӑмра). Р хакӗсене мӑшӑрлӑ t-тестпа палӑртнӑ (*Р<0,05, **Р<0,01 тата ***Р<0,001). Йӗрке танлаштарнӑ пациентсене (n = 6) кӑтартать. ФМО, флуоресценци минус пӗр; МФИ, вӑтам флуоресценци хӑватлӑхӗ.
Малаллахи анализсем питӗ лайӑх палӑртнӑ Т-клеткӑсен фенотип статусӗ хушшинчи ытти пысӑк уйрӑмлӑхсене тупса палӑртнӑ. Шыҫӑсенче активлӑ (1-мӗш ӳкерчӗк, G-ран пуҫласа I таран) тата эффекторлӑ астӑвӑм (1-мӗш ӳкерчӗк, J тата K) асцитран (CD3 + Т-клеткӑсен пайӗ) чылай ытларах пулать. Ҫавӑн пекех, фенотипа активаци маркерӗсен (CD25 тата CD137) тата деплеци маркерӗсен [программӑланӑ клетка вилӗмӗн белокӗ 1 (PD1)] экспрессийӗпе тишкерни ҫакна кӑтартнӑ: ҫак популяцисен метаболита характеристикисем тӗрлӗрен пулсан та (S1 ӳкерчӗк, B-ран пуҫласа E таран) , анчах та наивлӑ эффектсем хушшинче пӗр пек палӑрман метаболита уйрӑмлӑхӗсем палӑрман (S1 ӳкерчӗк, S1 ӳкерчӗк). ЭПӖ). Ҫак кӑтартусене машинӑллӑ вӗренӳ мелӗсемпе усӑ курса клеткӑсен фенотипӗсене автоматла уйӑрса ҫирӗплетнӗ (21), ҫакӑ вара пациентӑн асцитӗнче шӑмӑ мимин клеткисем (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) нумай пулнине малалла уҫса панӑ (S2A ӳкерчӗк). Пур палӑртнӑ клетка типӗсенчен те ҫак миелоид клеткисен популяцийӗ чи пысӑк глюкоза йышӑнӑвне тата митохондри активлӑхне кӑтартнӑ (S2 ӳкерчӗк, B-ран пуҫласа G таран). Ҫак кӑтартусем HGSC чирлисен асцитӗпе шыҫӑсенче тӗл пулакан нумай клетка тӗсӗсем хушшинчи вӑйлӑ ылмашӑну уйрӑмлӑхӗсене палӑртаҫҫӗ.
ТИЛӑн метабономиллӗ характеристикисене ӑнланса илме тӗп йывӑрлӑх вӑл — шыҫӑсенчен ҫителӗклӗ тасалӑхлӑ, пахалӑхлӑ тата йышлӑ Т-клеткӑсен пробисене уйӑрса илмелле. Юлашки вӑхӑтра тунӑ тӗпчевсем ҫакна кӑтартса панӑ: юхӑм цитометрийӗ ҫинче никӗсленнӗ сортировка тата шӑрҫа пуянлатмалли меслетсем клеткӑри метаболитсен профильне улӑштарма пултараҫҫӗ (22-24). Ҫак ыйтӑва татса парас тесе эпир LC-MS/MS мелӗпе анализ тӑвиччен хирурги мелӗпе касса кӑларнӑ ҫыннӑн ҫӑмарти ракӗнчен TIL уйӑрса илме шӑрҫа пуянлатмалли меслете оптимизацилерӗмӗр (Материалсемпе меслетсене пӑхӑр; 2А ӳкерчӗк). Ҫак протоколӑн метаболит улшӑнӑвӗсем ҫине пӗтӗмӗшле витӗм кӳнине хаклас тӗллевпе эпир ҫӳлти шӑрҫа уйӑрмалли тапхӑр хыҫҫӑн сывӑ донорсем активизациленӗ Т-клеткӑсен метаболит профильне шӑрҫа уйӑрман, анчах пӑр ҫинче юлнӑ клеткӑсемпе танлаштартӑмӑр. Ҫак пахалӑха тӗрӗслесе тӑракан анализ ҫак икӗ услови хушшинче пысӑк корреляци пуррине (r = 0,77) тата 86 метаболит ушкӑнӗн техника енчен тепӗр хут тума пултарни пысӑк тепӗр хут тума пултарнине палӑртнӑ (2-мӗш ӳкерчӗк, В). Ҫавӑнпа та ҫак меслетсем клетка типне пуянлатмалли клеткӑсенче метаболитсене тӗрӗс анализ тума пултараҫҫӗ, ҫапла вара HGSC-ри ятарлӑ метаболитсене тупса палӑртмалли пӗрремӗш пысӑк уйӑрӑмлӑ платформа пулса тӑраҫҫӗ, ҫапла майпа ҫынсене клеткӑсен спецификине тарӑнрах ӑнланма май параҫҫӗ.
(А) Магнит шӑрҫисене пуянлатмалли схема. ЖК-МС/МС мелӗпе анализ тӑвиччен клеткӑсем умлӑ-хыҫлӑ виҫӗ хутчен магнит шӑрҫисемпе пуянланӗҫ е пӑр ҫинче юлӗҫ. (B) Пуянлатмалли тӗс метаболитсен йышӗ ҫине мӗнле витӗм кӳни. Кашни пуянлатмалли тӗсшӗн виҫӗ виҫевӗн вӑтам виҫи ± SE. Сӑрӑ йӗр 1:1 ҫыхӑнӑва кӑтартать. Тӗнӗлӗн ярлыкӗнче кӑтартнӑ тепӗр хут виҫнӗ чухнехи класс ӑшӗнчи корреляци (ICC). NAD, никотинамид аденин динуклеотид. (C) Пациентсен метаболит анализӗн ӗҫ юхӑмӗн схематики. Асцит е шыҫӑ чирлисенчен пуҫтараҫҫӗ те криоконсервацилеҫҫӗ. Кашни пробӑн пӗчӗк пайне юхӑм цитометрипе анализланӑ, ытти пробӑсене вара CD4+, CD8+ тата CD45- клеткӑсемшӗн виҫӗ хутчен пуянлатнӑ. Ҫак клетка фракцийӗсене LC-MS/MS мелӗпе анализланӑ. (D) Стандартизациленӗ метаболитсен йышлӑхӗн ӑшӑ картти. Дендрограмма Уордӑн тӗслӗхсем хушшинчи Евклидовӑй хушӑсен кластеризацине кӑтартать. (Е) Тӗп компонентсен анализӗ (ТКА) тӗслӗх метаболит картти, кашни тӗслӗхӗн виҫӗ репликине кӑтартать, пӗр пациентран илнӗ тӗслӗхсене йӗрпе ҫыхӑнтараҫҫӗ. (F) пациент ҫине кондициленӗ пробӑн метаболит профилӗн PCA (т. е. пайӑн-пайӑн резервпа усӑ курса); тӗслӗх тӗсӗ мӑкӑрӑлчӑк корпуспа чикӗленет. ПК1, тӗп компонент 1; ПК2, тӗп компонент 2.
Унтан эпир ҫак пуянлатмалли меслетпе ултӑ HGSC чирлӗ ҫыннӑн малтанхи асцитӗпе шыҫҫисенчи CD4 +, CD8 + тата CD45-клеткӑсен фракцийӗсенчи 99 метаболита тишкерме усӑ куртӑмӑр (2С ӳкерчӗк, S3A ӳкерчӗк тата S3 тата S4 таблицӑсем). Интереслӗ популяци чӗрӗ клеткӑсен малтанхи пысӑк тӗслӗхӗн 2%-ран пуҫласа 70% таран йышӑнать, клеткӑсен пайӗ вара пациентсем хушшинче питӗ тӗрлӗрен. Шӑрҫасене уйӑрнӑ хыҫҫӑн пуянлатнӑ интереслӗ фракци (CD4+, CD8+ е CD45-) пробӑри мӗнпур чӗрӗ клеткӑсен вӑтамран 85% ытла йышӑнать. Ҫак пуянлатмалли меслет пире этем шыҫӑ тканӗсен ылмашӑнӑвӗнчен клеткӑсен популяцийӗсене тишкерме май парать, ҫакна пысӑк пробӑсенчен тума май ҫук. Ҫак протоколпа усӑ курса эпир l-кинуренинпа аденозин, ҫак икӗ лайӑх характеристика панӑ иммуносупрессивлӑ метаболит шыҫӑ Т-клеткисенче е шыҫӑ клеткисенче ӳснине палӑртрӑмӑр (S3, B тата C ӳкерчӗксем). Ҫавӑнпа та ҫак кӑтартусем пирӗн клеткӑсене уйӑрса илмелли тата масс-спектрометри технологийӗн шанчӑклӑхне тата пациентсен ӳт-тирӗнче биологи тӗлӗшӗнчен пӗлтерӗшлӗ метаболитсене тупма пултарнине кӑтартса параҫҫӗ.
Пирӗн анализ ҫавӑн пекех пациентсен хушшинче тата вӗсем хушшинче клеткӑсен тӗсӗсен вӑйлӑ ылмашӑну уйрӑмлӑхне палӑртрӗ (2D тата S4A ӳкерчӗксем). Уйрӑмах, ытти пациентсемпе танлаштарсан, 70-мӗш пациент тӗрлӗ ылмашӑну характеристикисене кӑтартнӑ (2Е тата S4В ӳкерчӗксем), ҫакӑ пациентсем хушшинче пысӑк ылмашӑну гетерогенлӑхӗ пулма пултарнине кӑтартать. Ытти пациентсемпе танлаштарсан (1,2-2 литр; S1 табл.) 70-мӗш пациентра пухнӑ асцитӑн пӗтӗмӗшле виҫи (80 мл) сахалрах пулнине палӑртмалла. Тӗп компонент анализӗ вӑхӑтӗнче пациентсем хушшинчи гетерогенлӑха тӗрӗслесе тӑни (сӑмахран, пайӑр редуцирлӑх анализӗпе усӑ курса) клетка типӗсем хушшинче пӗр пек улшӑнусем пулнине кӑтартать, клетка типӗсем тата/е микротавралӑх метаболит профильне кура уҫҫӑн пӗрлешсе тӑраҫҫӗ (2F ӳкерчӗк). Пӗр-пӗр метаболит анализӗ ҫак эффектсене палӑртнӑ тата клеткӑсен тӗсӗсемпе микротавралӑх хушшинчи пысӑк уйрӑмлӑхсене тупса палӑртнӑ. Ҫакна та палӑртмалла: чи пысӑк уйрӑмлӑх — МНА, вӑл ытларах чухне CD45- клеткӑсенче тата шыҫӑ ӑшне кӗрекен CD4+ тата CD8+ клеткӑсенче пуянланать (3А ӳкерчӗк). CD4 + клеткӑсемшӗн ку эффект ытларах палӑрать, CD8 + клеткӑсенчи МНА та тавралӑхран вӑйлӑ витӗм кӳнӗ пек туйӑнать. Анчах та ку пӗлтерӗшлӗ мар, мӗншӗн тесен ултӑ пациентран виҫҫӗшне ҫеҫ шыҫӑ CD8+ балӗсем тӑрӑх хаклама пулать. МНАсӑр пуҫне, асцитпа шыҫӑсенчи тӗрлӗ йышши клеткӑсенче, ТИЛ-ра япӑх палӑракан ытти метаболитсем те дифференциаллӑ пуян (S3 тата S4 сӑнӳкерчӗксем). Ҫавӑнпа та ҫак кӑтартусем малаллахи тӗпчевсем валли иммуномодуляторлӑ метаболитсен шанчӑклӑ пуххине уҫса параҫҫӗ.
(А) Асцитпа шыҫӑран CD4+, CD8+ тата CD45- клеткӑсенчи МНА нормализациленӗ содержанийӗ. Коробка графикӗ медианӑна (йӗр), квартильсем хушшинчи диапазона (рамка шарнирӗ) тата даннӑйсен диапазонне кӑтартать, квартильсем хушшинчи диапазонран 1,5 хут пысӑкрах (кадр мӑйӑхӗ). Пациент материалӗсемпе меслечӗсем ҫинче ҫырса кӑтартнӑ пек, Р хакне палӑртма пациентӑн лимма хакӗпе усӑ курӑр (*Р<0,05 тата **Р<0,01). (B) МНА ылмашӑнӑвӗн схематики (60). Метаболитсем: S-аденозил-1-метионин; SAH, S-аденозин-1-гомоцистеин; НА, никотинамид; МНА, 1-метилникотинамид; 2-PY, 1-метил- 2-пиридон-5-карбоксамид; 4-PY, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибоза; NMN, никотинамид мононуклеотид. Ферментсем (симӗс): NNMT, никотинамид N-метилтрансфераза; SIRT, сиртуинсем; NAMPT, никотинамид фосфорибозилтрансфераза; AOX1, альдегид оксидаза 1; NRK, никотинамид рибозид киназа; NMNAT, никотинамид моно Нуклеотид аденилат трансфераза; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилаза. (C) t-SNE scRNA-seq асцит (сӑрӑ) тата шыҫӑ (хӗрлӗ; n = 3 пациент). (D) scRNA-seq мелӗпе палӑртнӑ тӗрлӗ клетка популяцийӗсенче NNMT экспрессийӗ. (E) SK-OV-3, этем эмбрион пӳри (HEK) 293T, Т-клеткӑсенче тата MNA-па имҫамланӑ Т-клеткӑсенче NNMT тата AOX1 экспрессийӗ. Хуҫланнӑ экспрессие SK-OV-3 тӗлӗшӗнчен кӑтартнӑ. SEM-па экспресси йӗркине кӑтартнӑ (n = 6 сывӑ донор). Ct хакӗсем 35-рен пысӑкрах пулсан, вӗсене тупма ҫук (UD) тесе шутлаҫҫӗ. (F) SLC22A1 тата SLC22A2 экспрессийӗ SK-OV-3, HEK293T, Т-клеткӑсенче тата 8мМ МНА-па ӗҫленӗ Т-клеткӑсенче. Хуҫланнӑ экспрессие SK-OV-3 тӗлӗшӗнчен кӑтартнӑ. SEM-па экспресси йӗркине кӑтартнӑ (n = 6 сывӑ донор). Ct хакӗсем 35-рен пысӑкрах пулсан, вӗсене тупма ҫук (UD) тесе шутлаҫҫӗ. (G) МНА-па 72 сехет инкубациленӗ хыҫҫӑн активизациленӗ сывӑ донор Т-клеткисенчи клетка МНА содержанийӗ. SEM-па экспресси йӗркине кӑтартнӑ (n = 4 сывӑ донор).
МНА метил ушкӑнне S-аденозил-1-метионинран (SAM) никотинамид (NA) ҫине никотинамид N-метилтрансфераза (NNMT; 3В ӳкерчӗк) куҫарса туса кӑлараҫҫӗ. NNMT ҫыннӑн тӗрлӗ ракӗнче ытлашши экспрессиленет тата пролифераципе, инвазипе тата метастазсемпе ҫыхӑннӑ (25-27). ТМЭ-ри Т-клеткӑсенчи МНА ҫӑлкуҫне лайӑхрах ӑнланас тесе эпир scRNA-seq меслечӗпе усӑ курса виҫӗ HGSC пациентӑн асцитӗпе шыҫӑсенчи клетка типӗсем тӑрӑх NNMT экспрессине палӑртрӑмӑр (S5 табл.). 6500 яхӑн клеткӑна тишкерни ҫакна кӑтартнӑ: асцит тата шыҫӑ таврашӗнче NNMT экспрессийӗ фибробласт тата шыҫӑ клеткисен популяцийӗсемпе ҫеҫ чикӗленнӗ (3-мӗш ӳкерчӗк, С тата D). Палӑртма кӑмӑллӑ, PTPRC (CD45 +) экспрессилекен кирек мӗнле популяцире те NNMT экспрессийӗ палӑрмасть (3D тата S5A ӳкерчӗксем), ҫакӑ метаболит спектрӗнче тупнӑ MNA Т-клеткӑсене кӗртнине пӗлтерет. Альдегид оксидаза 1 (AOX1) экспрессийӗ MNA-на 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2-PYR) е 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид (4-PYR) туса хурать; 3В ӳкерчӗк) ҫавӑн пекех COL1A1 экспрессилекен фибробластсен популяцийӗпе ҫеҫ чикӗленет (S5A ӳкерчӗк), вӗсем пӗрле Т-клеткӑсен йӑлана кӗнӗ МНК ылмашӑнӑвӗн пултарулӑхӗ ҫуккине кӑтартаҫҫӗ. Ҫак MNA-па ҫыхӑннӑ генсен экспресси йӗркине HGSC чирлисен асцитӗнчен илнӗ иккӗмӗш никама пӑхӑнман клетка даннӑйӗсен пуххипе усӑ курса тӗрӗсленӗ (S5B ӳкерчӗк; n = 6) (16). Унсӑр пуҫне, MNA-па имҫамланӑ сывӑ донор Т-клеткӑсен йышлӑ полимеразӑллӑ сӑнчӑр реакцийӗн (qPCR) анализӗ ҫакна кӑтартнӑ: контроль SK-OV-3 ананас шыҫҫи клеткисемпе танлаштарсан, NNMT е AOX1 экспрессиленменнипе пӗрех (3Е ӳкерчӗк). Ҫак кӗтмен результатсем МНА фибробластсенчен е шыҫӑсенчен ТМЭ-ри юнашар Т-клеткӑсене секретланма пултарнине кӑтартаҫҫӗ.
Кандидатсем шутне ирӗлекен 22 (SLC22) ҫемйипе (SLC22A1, SLC22A2 тата SLC22A3) кодланӑ органикӑллӑ катион транспортерӗсен 1-3 (OCT1, OCT2 тата OCT3) ҫемйи кӗрет пулин те, МНА-н потенциаллӑ транспортерӗсем халӗ те паллӑ мар-ха (28) . Сывӑ донор Т-клеткисен мРНК-н QPCR-ӗ SLC22A1 экспрессийӗн пӗчӗк шайне, анчах SLC22A2 шайне тупма май ҫуккине кӑтартнӑ, ҫакӑ ун ҫинчен литературӑра маларах пӗлтернине ҫирӗплетнӗ (3F ӳкерчӗк) (29). Унпа танлаштарсан, SK-OV-3 ананас шыҫҫи клеткисен линийӗ икӗ транспортерӑн та пысӑк шайне кӑтартнӑ (3F ӳкерчӗк).
Т-клеткӑсем ют МНК йышӑнма пултарнине тӗрӗслес тӗллевпе сывӑ донор Т-клеткисене тӗрлӗ концентрациллӗ МНК пур чухне 72 сехет хушши ӳстернӗ. Экзогенлӑ МНА ҫук чухне МНА клеткӑри содержанине тупса палӑртма май ҫук (3G ӳкерчӗк). Анчах та экзогенлӑ МНКпа имҫамланӑ активлӑ Т-клеткӑсем клеткӑсенче МНК содержанийӗн дозӑран килекен ӳсӗмне кӑтартнӑ, 6 мМ МНК таран (3G ӳкерчӗк). Ку результат транспортер экспрессийӗн шайӗ пӗчӗк пулнине тата клетка ӑшӗнчи МНК ылмашӑнӑвӗшӗн яваплӑ тӗп фермент ҫуккине пӑхмасӑрах, ТИЛ МНК йышӑнма пултарнине кӑтартать.
Пациентсен Т-клеткисенчи метаболитсен спектрӗ тата in vitro МНК йышӑнӑвӗн экспериментӗсем ракпа ҫыхӑннӑ фибробластсем (КАФ) МНК уйӑрма пултарассине ӳстереҫҫӗ тата шыҫӑ клеткисем ТИЛ фенотипне тата функцине йӗркелеме пултараҫҫӗ. МНА Т-клеткӑсем ҫине мӗнле витӗм кӳнине палӑртас тесе сывӑ донор Т-клеткисене МНА пур чухне е ҫук чухне in vitro активизациленӗ, вӗсен пролиферацине тата цитокин туса кӑларассине хакланӑ. Чи пысӑк дозӑпа МНА хушнӑ хыҫҫӑн 7 кунран халӑх йышӗ икӗ хут ӳсни вӑтам шайра чакнӑ, ҫав вӑхӑтрах пур дозӑра та вӑй-хал упранса юлнӑ (4А ӳкерчӗк). Унсӑр пуҫне, экзогенлӑ МНКпа сипленни CD4 + тата CD8 + Т-клеткӑсен шыҫӑ некрозӗн факторне-α (TNFα; 4В ӳкерчӗк) экспрессилекен пайне ӳстерме май панӑ. Унпа танлаштарсан, CD4 + Т-клеткӑсенче IFN-γ клетка ӑшӗнче туса кӑларасси палӑрмаллах чакнӑ, анчах CD8 + Т-клеткӑсенче мар, интерлейкин 2-ре палӑрмаллах улшӑну пулман (IL-2; 4-мӗш ӳкерчӗк, С тата D). Ҫавӑнпа та ҫак МНА-па имҫамланӑ Т-клетка культурисенчен илнӗ супернатантсен ферментпа ҫыхӑннӑ иммуносорбент анализӗ (ИФА) TNFα палӑрмаллах ӳснине, IFN-γ чакнине тата IL-2 улшӑнманнине кӑтартнӑ (4-мӗш ӳкерчӗк, Е-ран пуҫласа G таран). . IFN-γ чакни MNA Т-клеткӑсен шыҫӑна хирӗҫле ӗҫне чарас ӗҫре пысӑк вырӑн йышӑнма пултарнине пӗлтерет. Т-клеткӑсем урлӑ пулакан цитотоксичность ҫине МНА витӗмне имитацилес тӗллевпе сывӑ донор периферири юн мононуклеарлӑ клеткисем (PBMC) урлӑ симӗс флуоресцентлӑ белок (GFP) -CAR-T клеткисемпе йӗркеленекен фолат рецепторӗ α тата CAR-T (GFP) ҫине тӗллев лартнӑ химерлӑ антиген рецепторӗ Т (FRα-CAR-T) клеткисем туса кӑлараҫҫӗ. CAR-T клеткисене 24 сехет хушши MNA пур чухне ӳстернӗ, унтан этем SK-OV-3 шыҫӑ клеткисемпе пӗрле ӳстернӗ, вӗсем α фолат рецепторне экспрессилеҫҫӗ, эффекторпа мишень шайлашӑвӗпе 10:1. МНА имҫамӗ FRα-CAR-T клеткисен вӗлерекен активлӑхне палӑрмаллах чакарнӑ, ку вара аденозинпа имҫамланӑ FRα-CAR-T клеткисемпе пӗр пек пулнӑ (4Н ӳкерчӗк).
(А) 7-мӗш кун культурӑран илнӗ пӗтӗмӗшле пурнӑҫлӑ клеткӑсен шучӗ тата популяци икӗ хут ӳсни (PD). Гистограмма ултӑ сывӑ донорӑн вӑтам + SEM кӑтартать. Сахалтан та n = 3 никама пӑхӑнман экспериментран илнӗ даннӑйсене кӑтартать. (B to D) CD3/CD28 тата IL-2 7 кун хушши Т-клеткӑсене хӑйсен МНК концентрацийӗсенче активизацилеме усӑ курнӑ. Анализ умӗн клеткӑсене 4 сехет хушши GolgiStop-па PMA/иономицинпа стимуляциленӗ. TNFα (B) экспрессийӗ Т-клеткӑсенче. Чӗрӗ клеткӑсенчи TNFα экспрессийӗн тӗслӗх ӳкерчӗкӗ (сулахайра) тата таблицӑллӑ даннӑйсем (сылтӑмра). Т-клеткӑсенче IFN-γ (C) тата IL-2 (D) экспрессийӗ. Цитокинсен экспрессине юхӑм цитометрипе виҫнӗ. Гистограмма вӑтам (n = 6 сывӑ донор) + SEM кӑтартать. Р хакне палӑртма дисперсие пӗр енлӗ анализпа тата тепӗр хут виҫсе (*Р<0,05 тата **Р<0,01) усӑ курӑр. Сахалтан та n = 3 никама пӑхӑнман экспериментран илнӗ даннӑйсене кӑтартать. (E to G) CD3/CD28 тата IL-2 7 кун хушши Т-клеткӑсене хӑйсен MNA концентрацийӗсенче активизацилеме усӑ курнӑ. ПМА/иономицин стимуляцийӗн 4 сехетӗ умӗн тата хыҫҫӑн хутлӑха пухнӑ. TNFα (E), IFN-γ (F) тата IL-2 (G) концентрацийӗсене ИФА мелӗпе виҫнӗ. Гистограмма вӑтам (n = 5 сывӑ донор) + SEM кӑтартать. Р хакне дисперсие пӗр енлӗ анализпа тата тепӗр хут виҫсе палӑртнӑ (*Р<0,05). Пӑнчӑллӑ йӗр тупмалли чикӗне кӑтартать. (H) Клеткӑсен лизисӗн анализӗ. FRα-CAR-T е GFP-CAR-T клеткисене 24 сехет хушши аденозинпа (250 мкМ) е МНАпа (10 мМ) тӳрлетнӗ е имҫамламасӑр хӑварнӑ (Ctrl). SK-OV-3 клеткӑсен вилӗм процентне виҫнӗ. Р хакне Уэлч t-тестӗпе палӑртнӑ (*Р<0,5 тата **Р<0,01).
MNA-зависимӑй TNFα экспресси регуляцийӗн механизмлӑ ӑнланӑвне илме MNA-па имҫамланӑ Т-клеткӑсен TNFα мРНК улшӑнӑвӗсене хакланӑ (5А ӳкерчӗк). МНКпа имҫамланӑ сывӑ донор Т-клеткисем ТНФα транскрипцийӗн шайӗ икӗ хут ӳснине кӑтартнӑ, ҫакӑ МНА ТНФα транскрипци регуляцийӗнчен килнине пӗлтерет. Ҫак пулма пултаракан регуляторлӑ механизма тӗпчес тӗллевпе TNFα-на йӗркелекен икӗ паллӑ транскрипци факторне, урӑхла каласан, активлӑ Т-клеткӑсен ядерлӑ факторне (NFAT) тата ятарлӑ белок 1 (Sp1), MNA проксималлӑ TNFα промоторӗпе ҫыхӑннине хирӗҫ хакланӑ ( 30). TNFα промоторӗнче 6 палӑртнӑ NFAT ҫыхӑну вырӑнӗ тата 2 Sp1 ҫыхӑну вырӑнӗ пур, вӗсем пӗр вырӑнта пӗр-пӗринпе ҫыхӑнса тӑраҫҫӗ [5'cap-ран -55 никӗс мӑшӑрӗ (bp)] (30). Хроматин иммунопреципитацийӗ (ХИП) кӑтартнӑ тӑрӑх, МНАпа имҫамланӑ чухне Sp1 TNFα промоторӗпе ҫыхӑнасси виҫӗ хут ӳснӗ. NFAT кӗртни те ӳссе пычӗ тата унӑн пӗлтерӗшне ҫывхартрӗ (5-мӗш ӳкерчӗк, В). Ҫак кӑтартусем MNA Sp1 транскрипцийӗ урлӑ TNFα экспрессине йӗркелесе тӑнине, NFAT экспрессине вара сахалрах шайра йӗркеленине кӑтартаҫҫӗ.
(А) МНАсӑр культурӑланӑ Т-клеткӑсемпе танлаштарсан, МНА-па имҫамланӑ Т-клеткӑсенче TNFα экспрессийӗн хут улшӑнӑвӗ. SEM-па экспресси йӗркине кӑтартнӑ (n = 5 сывӑ донор). Сахалтан та n = 3 никама пӑхӑнман экспериментран илнӗ даннӑйсене кӑтартать. (B) NFAT тата Sp1 хыҫҫӑн 8 мМ MNA-па е унсӑрӑн ӗҫленӗ Т-клеткӑсен TNFα промоторне (Ctrl) тата PMA/иономицин стимуляцийӗпе 4 сехет хушши пӗрлештернӗ. Иммунопреципитаци валли отрицательнӑй тата позитивлӑ контроль вырӑнне иммуноглобулин G (IgG) тата H3 усӑ курнӑ. ChIP виҫине палӑртнӑ тӑрӑх, MNA-па имҫамланӑ клеткӑсенче Sp1 тата NFAT TNFα промоторӗпе ҫыхӑнасси контрольпе танлаштарсан темиҫе хут ӳснӗ. Сахалтан та n = 3 никама пӑхӑнман экспериментран илнӗ даннӑйсене кӑтартать. Р хакне нумай t-тестсемпе палӑртнӑ (*** Р <0,01). (C) HGSC асцитӗпе танлаштарсан, Т-клеткӑсем (цитотоксиклӑ мар) шыҫӑра TNF экспрессине ӳстернине кӑтартнӑ. Тӗссем тӗрлӗ пациента кӑтартаҫҫӗ. Кӑтартнӑ клеткӑсене 300 таран ӑнсӑртлӑн суйласа илнӗ те ытлашши ӳкерме чарас тесе ҫӗтӗк-ҫатӑк тунӑ (** Padj = 0,0076). (D) Яичник ракӗ валли сӗннӗ МНА моделӗ. МНА шыҫӑ клеткисенче тата ТМЭ-ри фибробластсенче пулать, ӑна Т-клеткӑсем йышӑнаҫҫӗ. МНА Sp1-ӑн TNFα промоторӗпе ҫыхӑнассине ӳстерет, ҫакӑ вара TNFα транскрипцине тата TNFα цитокин туса кӑларассине ӳстерет. МНА та IFN-γ шайне чакарать. Т-клеткӑсен ӗҫне пӳлни вӗлерме пултарассине чакарать тата шыҫӑ ӳсӗмне хӑвӑртлатать.
Пӗлтернӗ тӑрӑх, TNFα малти тата хыҫалти шыҫӑсене хирӗҫле тата шыҫӑсене хирӗҫле витӗм кӳрет, анчах та вӑл ананас ракӗн ӳсӗмне тата метастазӗсене пулӑшас ӗҫре лайӑх паллӑ роль вылять (31-33). Пӗлтернӗ тӑрӑх, ҫӑмарта шыҫҫипе чирлекенсен асцитпа шыҫӑ тканӗсенче TNFα концентрацийӗ ырӑ ӳт-тирсенчен пысӑкрах (34-36). Механизм тӗлӗшӗнчен илсен, TNFα шурӑ юн тымарӗсен активацине, ӗҫне тата пролиферацине йӗркелеме, рак клеткисен фенотипне улӑштарма пултарать (37, 38). Ҫак кӑтартусемпе килӗшӳллӗн, дифференциаллӑ ген экспрессийӗн анализӗ ҫакна кӑтартнӑ: ТНФ шыҫӑ тканӗсенчи Т-клеткӑсенче асцитпа танлаштарсан палӑрмаллах ӳснӗ (5С ӳкерчӗк). ТНФ экспрессийӗ ӳсни цитотоксиклӑ мар фенотиплӑ Т-клеткӑсен популяцийӗсенче кӑна палӑрнӑ (S5A ӳкерчӗк). Пӗтӗмлетсе каласан, ҫак кӑтартусем MNA HGSC-ра икӗ енлӗ иммуносупрессивлӑ тата шыҫӑ аталантаракан эффектсем пур текен шухӑша ҫирӗплетеҫҫӗ.
Юхӑм цитометрийӗ ҫинче никӗсленнӗ флуоресцентлӑ маркировка ТИЛ ылмашӑвне тӗпчемелли тӗп меслет пулса тӑчӗ. Ҫак тӗпчевсем ҫакна кӑтартса панӑ: периферири юн лимфоцичӗсемпе е иккӗмӗш лимфоид органӗсенчи Т-клеткӑсемпе танлаштарсан, шӑши тата этем ТИЛӗсем глюкозӑна йышӑнма ытларах туртӑнаҫҫӗ (4, 39) тата митохондри ӗҫне майӗпен ҫухатаҫҫӗ (19, 40). Ҫак тӗпчевре эпир ҫакӑн пек результатсем асӑрхарӑмӑр пулин те, тӗп аталану — пӗр резекциленӗ шыҫӑ тканӗнчен шыҫӑ клеткисемпе ТИЛ ылмашӑнӑвне танлаштарасси. Ҫак малтанхи докладсенчен хӑшӗ-пӗрисемпе килӗшӳллӗн, асцитпа шыҫӑсенчен пулакан шыҫӑ (CD45-EpCAM +) клеткисем CD8 + тата CD4 + Т-клеткӑсенчен ытларах глюкоза йышӑнаҫҫӗ, ҫакӑ шыҫӑ клеткисен пысӑк глюкоза йышӑнӑвне Т-клеткӑсемпе танлаштарма май пуррине ҫирӗплетет. Т-клеткӑсен ӑмӑртӑвӗн ӑнлавӗ. ТМЭ. Анчах та шыҫӑ клеткисен митохондри активлӑхӗ CD8 + Т-клеткӑсенчен пысӑкрах, анчах митохондри активлӑхӗ CD4 + Т-клеткӑсенни пекех. Ҫак кӑтартусем шыҫӑ клеткисемшӗн оксидациллӗ ылмашӑну пӗлтерӗшлӗ текен ҫӗнӗ темӑна ҫирӗплетеҫҫӗ (41, 42). Вӗсем ҫавӑн пекех CD8 + Т-клеткӑсем CD4 + Т-клеткӑсенчен ытларах оксидациллӗ дисфункцие сисӗмлӗ пулма пултарнине е CD4 + Т-клеткӑсем митохондри ӗҫне тытса тӑма глюкозӑсӑр пуҫне урӑх углерод ҫӑлкуҫӗсемпе усӑ курма пултарнине палӑртаҫҫӗ (43, 44). Ҫакна та палӑртмалла: эпир асцитра CD4 + Т эффекторсем, Т эффекторсен астӑвӑмӗ тата Т центральнӑй астӑвӑм клеткисем хушшинче глюкоза йышӑнӑвӗнче е митохондри активлӑхӗнче уйрӑмлӑх асӑрхаман. Ҫавӑн пекех шыҫӑсенчи CD8 + Т-клеткӑсен дифференциаци тӑрӑмӗ глюкоза йышӑнӑвӗн улшӑнӑвӗсемпе нимӗнле ҫыхӑну та тытмасть, ҫакӑ in vitro культурӑланӑ Т-клеткӑсемпе in vivo этем TIL хушшинчи пысӑк уйрӑмлӑха палӑртать (22). Ҫак сӑнавсене клеткӑсен популяцийӗсене тӗрӗс мар автоматла уйӑрса панипе те ҫирӗплетнӗ, ҫакӑ вара CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + клеткӑсем шыҫӑ клеткисенчен ытларах глюкоза йышӑнӑвӗпе тата митохондри активлӑхӗпе ытларах пулнине, анчах вӗсен Метаболизм активлӑ клеткисен популяцийӗ пуррине уҫса панӑ. Ку популяци scRNA-seq анализӗнче тупса палӑртнӑ миелоид супрессор клеткисен е плазмоцитоид дендрит клеткисен шутланакан субпопуляцине кӑтартма пултарать. Ҫаксем иккӗшӗ те ҫыннӑн ананас шыҫҫисенче пулнине пӗлтернӗ пулин те [45], вӗсене ҫапах та кирлӗ.
Юхӑм цитометрийӗ ҫинче никӗсленнӗ меслетсем клетка тӗсӗсем хушшинчи глюкоза тата оксидациллӗ ылмашӑну енӗпе пӗтӗмӗшле уйрӑмлӑхсене уҫӑмлатма пултараҫҫӗ пулин те, ТМЭ-ре митохондри ылмашӑнӑвӗ валли глюкоза е ытти углерод ҫӑлкуҫӗсем туса кӑларакан тӗрӗс метаболитсене хальлӗхе палӑртман-ха. Пӗр-пӗр TIL подмножествине метаболитсем пуррипе ҫуккине палӑртма касса илнӗ тканьрен клетка популяцине тасатмалла. Ҫавӑнпа та пирӗн клеткӑсене пуянлатмалли меслет масс-спектрометрипе пӗрлештерсе пациентсен танлаштаруллӑ тӗслӗхӗсенче Т-клеткӑсемпе шыҫӑ клеткисен популяцийӗсенче дифференциаллӑ пуянланнӑ метаболитсем ҫинчен пӗлме май парать. Ку меслет флуоресценципе активизациленӗ клеткӑсене сортлассинчен лайӑхрах пулсан та, хӑш-пӗр метаболитсен библиотекисем ҫирӗплӗхпе тата/е хӑвӑрт ҫаврӑну хӑвӑртлӑхӗпе ҫыхӑннӑ витӗм кӳме пултараҫҫӗ (22). Апла пулин те пирӗн меслет икӗ паллӑ иммуносупрессивлӑ метаболита, аденозинпа кинуренина, тупса палӑртма пултарчӗ, мӗншӗн тесен вӗсем проба тӗсӗсем хушшинче питӗ тӗрлӗрен.
Пирӗн шыҫӑсен тата TIL подтипӗсен метабономиллӗ анализӗ ананас TME-ри метаболитсен рольне ытларах ӑнланма май парать. Малтанах, юхӑм цитометрипе усӑ курса, эпир шыҫӑсемпе CD4 + Т-клеткӑсем хушшинче митохондрисен ӗҫӗнче уйрӑмлӑх ҫуккине палӑртрӑмӑр. Анчах та LC-MS/MS анализӗ ҫак популяцисен хушшинче метаболитсен йышӗнче палӑрмаллах улшӑнусем пулнине палӑртнӑ, ҫакӑ вара TIL метаболизмӗ тата унӑн пӗтӗмӗшле метаболита ӗҫӗ ҫинчен пӗтӗмлетӳсем тума тимлӗн ӑнлантарса памаллине кӑтартать. Иккӗмӗшӗнчен, МНА — асцитра мар, асцитра CD45-клеткӑсемпе Т-клеткӑсем хушшинче чи пысӑк уйрӑмлӑхлӑ метаболит. Ҫавӑнпа та компартментализаци тата шыҫӑ вырнаҫӑвӗ ТИЛ ылмашӑнӑвӗ ҫине тӗрлӗ витӗм кӳме пултараҫҫӗ, ҫакӑ вара панӑ микротавралӑхра пулма пултаракан гетерогенлӑха палӑртать. Виҫҫӗмӗшӗнчен, МНК туса кӑларакан фермент NNMT экспрессийӗ тӗпрен илсен CAF-па ҫеҫ чикӗленет, вӑл вара шыҫӑ клеткисем сахалрах, анчах шыҫӑран пулса кайнӑ Т-клеткӑсенче тупса палӑртма май пур МНА шайӗсене асӑрхаҫҫӗ. Яичникри CAF-ра NNMT ытлашши экспресси пулни рак аталанӑвне аталантаракан паллӑ витӗм кӳрет, ҫакӑ вара CAF ылмашӑнӑвне, шыҫӑ инвазине тата метастазсене аталантарнипе ҫыхӑннӑ (27). ТИЛӑн пӗтӗмӗшле шайӗ вӑтам пулин те, CAF-ра NNMT экспрессийӗ Cancer Genome Atlas (TCGA) мезенхимӑллӑ подтипӗпе тачӑ ҫыхӑннӑ, вӑл начар прогнозпа ҫыхӑннӑ (27, 46, 47). Юлашкинчен, МНК ҫӗмӗрӗлӗвӗшӗн яваплӑ AOX1 ферментӑн экспрессийӗ те CAF популяцийӗпе ҫеҫ чикӗленет, ку вара Т-клеткӑсем МНК-на метаболизацилеме пултарайманнине пӗлтерет. Ҫак кӑтартусем ҫак шухӑша ҫирӗплетеҫҫӗ: ҫак тупӑшӑва тӗрӗслесе пӑхма малалла ӗҫлемелле пулин те, Т-клеткӑсенче МНА шайӗ пысӑк пулни иммуносупрессивлӑ CAF микротавралӑхӗ пуррине кӑтартма пултарать.
МНК транспортерӗсен экспресси шайӗ пӗчӗк пулнине тата МНК ылмашӑнӑвӗнче хутшӑнакан тӗп белоксен тупма май ҫук шайне шута илсен, Т-клеткӑсенче МНК пурри кӗтмен ҫӗртен пулать. NNMT та, AOX1 та scRNA-seq анализӗпе тата икӗ никама пӑхӑнман когортӑн тӗллевлӗ qPCR мелӗпе тупса палӑртма май килмерӗ. Ҫак кӑтартусем МНА Т-клеткӑсем синтезланманнине, ӑна таврари ТМЭ-ран йышӑннине кӑтартаҫҫӗ. In vitro экспериментсем Т-клеткӑсем экзогенлӑ МНК пухма юратнине кӑтартаҫҫӗ.
Пирӗн in vitro тӗпчевсем ҫакна кӑтартса пачӗҫ: экзогенлӑ МНА Т-клеткӑсенче TNFα экспрессине аталантарать тата Sp1 TNFα промоторӗпе ҫыхӑнассине вӑйлатать. TNFα шыҫӑна хирӗҫле тата шыҫӑна хирӗҫле функцисем пур пулин те, ананас ракӗнче TNFα ананас ракӗн ӳсӗмне пулӑшма пултарать (31-33). Яичниксен шыҫӑ клеткисен культуринче TNFα нейтрализацийӗ е шӑши моделӗсенче TNFα сигналне пӗтерни TNFα-медиациллӗ шыҫӑ цитокинӗсене туса кӑларассине лайӑхлатма тата шыҫӑ ӳсӗмне чарма пултарать (32, 35). Ҫавӑнпа та ку тӗслӗхре ТМЭ-ран илнӗ МНА аутокринлӑ петле урлӑ ТНФα-ран килекен механизм урлӑ провоспалительнӑй метаболит пулса ӗҫлеме пултарать, ҫавна май ананас ракӗ пулма тата сарӑлма пулӑшать (31). Ҫак майсене тӗпе хурса, TNFα блокадине ҫӑмарта шыҫҫин потенциаллӑ сиплев агентӗ пек тӗпчеҫҫӗ (37, 48, 49). Унсӑр пуҫне, МНА CAR-T клеткисен ананас шыҫҫи клеткисем ҫине цитотоксичлӑхне пӑсать, ҫакӑ МНА-медиациллӗ иммунлӑ супрессие ҫирӗплетсе парать. Пӗтӗмӗшле илсен, ҫак кӑтартусем шыҫӑсемпе CAF клеткисем MNA-на клетка тулашӗнчи TME-на уйӑракан модель сӗнеҫҫӗ. (i) ТНФ-индуцированнӑй ананас ракӗн ӳсӗмне хавхалантарни тата (ii) МНА-индуцированнӑй Т-клеткӑсен цитотоксиклӑ активлӑхне чакарни урлӑ ку икӗ енлӗ шыҫӑ эффектне кӳме пултарать (5D ӳкерчӗк).
Пӗтӗмлетсе каласан, хӑвӑрт клеткӑсене пуянлатмалли, пӗр клеткӑллӑ секвенировани тата метаболита профильне пӗрлештерсе, ҫак тӗпчев HGSC чирлисен шыҫӑсемпе асцит клеткисем хушшинчи пысӑк иммунометаболоми уйрӑмлӑхӗсене уҫса панӑ. Ҫак пур енлӗ анализ Т-клеткӑсем хушшинче глюкозӑна йышӑнассипе митохондрисен ӗҫӗнче уйрӑмлӑхсем пуррине кӑтартнӑ, ҫавӑн пекех МНА-на клеткӑллӑ мар автономлӑ иммунлӑ регуляторлӑ метаболит тесе палӑртнӑ. Ҫак кӑтартусем ҫыннӑн рак чирӗсенче ТМЭ Т-клеткӑсен ылмашӑвне мӗнле витӗм кӳнине витӗм кӳреҫҫӗ. Т-клеткӑсемпе рак клеткисем хушшинче апат-ҫимӗҫшӗн тӳрремӗнех тупӑшни ҫинчен пӗлтернӗ пулин те, метаболитсем шыҫӑ аталанӑвне пулӑшма тата, тен, эндогенлӑ иммунлӑ хуравсене пусарма тӳрӗ мар регуляторсем пулса та ӗҫлеме пултараҫҫӗ. Ҫак регуляторлӑ метаболитсен функциллӗ рольне малалла ҫырса кӑтартни шыҫӑна хирӗҫле иммунлӑ хуравне вӑйлатмалли альтернативлӑ стратегисем уҫма пултарать.
Пациентсен экземплярӗсене тата клиника даннӑйӗсене Канада ткань репозиторийӗсен сечӗ сертификациленӗ BC рак шыҫӑ тканьӗсен репозиторийӗ урлӑ илнӗ. Британи Колумбийӗн рак чирӗсене тӗпчекен этика комитечӗ тата Британи Колумбийӗн университетӗ (H07-00463) ҫирӗплетнӗ протокол тӑрӑх, пур пациентсен экземплярӗсемпе клиника даннӑйӗсем те ҫырса панӑ килӗшӳ илнӗ е килӗшӳрен официаллӑ майпа пӑрӑннӑ. Тӗслӗхсене сертификатлӑ Биобанкра (BRC-00290) упраҫҫӗ. Пациентсен тӗплӗ характеристикисене S1 тата S5 таблицӑсенче кӑтартнӑ. Криоконсерваци валли скальпельпе усӑ курса пациентӑн шыҫӑ пробине механикӑлла майпа ҫӗмӗреҫҫӗ те ӑна 100 микронлӑ фильтр витӗр кӑларса пӗр клеткӑллӑ суспензи илеҫҫӗ. Пациентӑн асцитне 1500 ҫаврӑм/мин хӑвӑртлӑхпа 10 минут хушши 4°C температурӑра центрифугӑланӑ, ҫапла майпа клеткӑсене пеллетланӑ тата ҫиелти сийне кӑларнӑ. Шыҫӑран тата асцитран илнӗ клеткӑсене 50% ӑшӑпа инактивациленӗ ҫыннӑн АВ сывороткинче (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) тата 10% диметилсульфоксидра криоконсервациленӗ. Ҫак упранса юлнӑ пӗр клеткӑллӑ суспензисене ирӗлтернӗ те метаболомикӑпа метаболитсене палӑртма усӑ курнӑ, ҫакна ҫакӑн пек ҫырса кӑтартнӑ.
Пӗтӗмӗшле хутлӑх 0,22 мкм фильтрланӑ 50:50 хушса панӑ RPMI 1640: AimV-ран тӑрать. RPMI 1640 + 2,05 мМ l-глутамин (Thermo Fisher Scientific) 10% ӑшӑпа инактивациленӗ этем AB сывороткипе (Sigma-Aldrich), 12,5 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 мМ l-глутамин (Thermo Fisher Scientific) хушса панӑ, x1 Пенициллин стрептомицин (PenStrep) ирӗлчӗкӗ (Thermo Fisher Scientific) тата 50 мкМБ-меркаптоэтанол. AimV (Invitrogen) 20 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific) тата 2 мМ l-глутамин (Thermo Fisher Scientific) хушса панӑ. Юхӑм цитометрӗн сӑрлав буферӗ 0,22 мкм фильтрланӑ фосфатлӑ буферлӑ тӑварлӑ шывран (PBS; Invitrogen) 3% ӑшӑпа инактивациленӗ AB этем сывлавӗпе (Sigma) хушнӑ. Клеткӑсене пуянлатмалли буфер 0,22 мкм фильтрланӑ PBS-ран тӑрать тата 0,5% ӑшӑпа инактивациленӗ этем AB сывороткипе (Sigma-Aldrich) хушӑнать.
37°C тулли хутлӑхра клеткӑсене 10 нМ МТ ДР тата 100 мкМ 2-НБДГ 30 минут хушши сӑрланӑ. Унтан клеткӑсене 4°C температурӑра 15 минут хушши eF506 пурнӑҫлӑх сӑрӗпе сӑрланӑ. Клеткӑсене FC Block (eBioscience) тата Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) ҫинче тепӗр хут суспендированилемелле, юхӑм цитометрӗн сӑрлав буферӗнче ирӗлтермелле (производитель инструкцийӗпе килӗшӳллӗн) тата пӳлӗм температуринче 10 минут хушши инкубацилемелле. Клеткӑсене антителасен пуххипе (S2 табл.) 4°C температурӑра 20 минут хушши юхӑм цитометрипе сӑрламалли буферта сӑрламалла. Анализ умӗн клеткӑсене юхӑм цитометрипе сӑрламалли буферта (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигураци) тепӗр хут суспендированилемелле. Клеткӑсен шучӗн даннӑйӗсене тишкерме SpectroFlo тата FlowJo V10 программӑсемпе усӑ курӑр, даннӑйсене тума GraphPad Prism 8 программӑпа усӑ курӑр. 2-NBDG тата MT DR-ӑн вӑтам флуоресценци хӑватлӑхне (MFI) лог-нормализациленӗ, унтан танлаштарнӑ пациентсене шута илме статистика анализӗ валли мӑшӑрлӑ t-тестпа усӑ курнӑ. Анализран 40-ран сахалрах пулӑмлӑ пур популяцие те кӑларса пӑрахмалла; статистика анализне тата даннӑйсене визуализацилеме тытӑниччен кирек мӗнле отрицательнӑй хаксемшӗн те 1 MFI хакне кӗртӗр.
Ҫӳлти процесс панелӗн алӑпа тунӑ шлюз стратегине хушса парас тесе эпир FlowJo-ри вилӗ клеткӑсене пӗтернӗ хыҫҫӑн популяцие клеткӑсене автоматла майпа уйӑрса пама формӑна чикӗлекен йывӑҫ (FAUST) (21) тӑрӑх тулли аннотаципе усӑ куртӑмӑр. Эпир тухӑҫа алӑпа ертсе пыратпӑр, ҫапла майпа тӗрӗс мар уйӑрнӑ пек туйӑнакан популяцисене (PD1+ PD1-шыҫӑ клеткисемпе пӗрлештерсе) тата сыхласа хӑварнӑ популяцисене пӗрлештеретпӗр. Кашни пробӑра вӑтамран 2% ытла клетка пур, пурӗ 11 популяци.
ПБМК-на лейкоцит уйӑрмалли продуктсенчен (STEMCELL Technologies) уйӑрма Фиколл градиентлӑ ҫӑра центрифугированипе усӑ курнӑ. CD8 + Т-клеткӑсене PBMC-ран CD8 MicroBeads (Miltenyi) мелӗпе уйӑрнӑ та TransAct (Miltenyi) мелӗпе 2 эрне хушши производитель инструкцийӗпе килӗшӳллӗн тулли хутлӑхра сарнӑ. Клеткӑсене 5 кун хушши IL-7 (10 нг/мл; PeproTech) хушнӑ тулли хутлӑхра лартнӑ, унтан TransAct-па тепӗр хут стимуляциленӗ. 7-мӗш кунне, производитель инструкцийӗ тӑрӑх, этем CD45 MicroBeads (Miltenyi) виҫӗ хутчен умлӑ-хыҫлӑ клеткӑсене пуянлатма усӑ курнӑ. Клеткӑсене юхӑм цитометри анализӗ валли уйӑрнӑ (ҫӳлте ҫырса кӑтартнӑ пек), LC-MS/MS анализӗ валли пӗр миллион клеткӑна виҫӗ хутчен уйӑрнӑ. Пробӑсене ҫакӑн пек ҫырса кӑтартнӑ пек LC-MS/MS мелӗпе ӗҫленӗ. Эпир ҫитмен метаболит хакне 1000 ион шучӗпе хакларӑмӑр. Кашни пробӑна пӗтӗмӗшле ион шучӗпе (TIC) нормализацилеҫҫӗ, анализ умӗн MetaboAnalystR-ра логарифмла куҫараҫҫӗ те автоматла майпа нормализацилеҫҫӗ.
Кашни пациентӑн пӗр клеткӑллӑ суспензине ирӗлтернӗ те 40 мкм фильтр витӗр тулли хутлӑха (ҫӳлте ҫырса кӑтартнӑ пек) сӑрӑхтарнӑ. Производитель протоколӗпе килӗшӳллӗн, CD8+, CD4+ тата CD45- клеткӑсем валли (пӑр ҫинче) пробӑсене пуянлатма MicroBeads (Miltenyi) меслечӗпе усӑ курса магнитлӑ шӑрҫа уйӑрса виҫӗ хутчен умлӑ-хыҫлӑ лайӑх суйласа илнӗ. Кӗскен каласан, клеткӑсене клеткӑсене пуянлатмалли буферта (ҫӳлте ҫырса кӑтартнӑ пек) ҫӗнӗрен лартаҫҫӗ те шутлаҫҫӗ. Клеткӑсене этем CD8 шӑрҫисемпе, этем CD4 шӑрҫисемпе е этем CD45 шӑрҫисемпе (Miltenyi) 4°C температурӑра 15 минут хушши инкубациленӗ, унтан клеткӑсене пуянлатмалли буферпа ҫуса тасатнӑ. Тӗслӗхе LS колонки витӗр (Miltenyi) кӑлараҫҫӗ, унтан лайӑх тата япӑх фракцисене пуҫтараҫҫӗ. Вӑхӑта чакарас тата клеткӑсене ҫӗнӗрен йӗркелесе ҫитермелли тапхӑра ӳстерес тӗллевпе CD8-фракцие вара CD4+ пуянлатмалли иккӗмӗш турта, CD4-фракцие вара CD45-пуянлатма усӑ кураҫҫӗ. Уйрӑм тапхӑрта ирӗлчӗке пӑр ҫинче тытмалла.
Метаболит анализӗ валли пробӑсем хатӗрлеме клеткӑсене пӑр пек сивӗ тӑвар ирӗлчӗкӗпе пӗрре ҫуса тасатнӑ, кашни пробӑна 1 мл 80% метанол хушнӑ, унтан шӗвек азотра ҫавӑрса ҫавӑрнӑ та шӑнтнӑ. Пробӑсене виҫӗ хутчен шӑнтмалли-ирӗлтермелли цикл витӗр кӑларнӑ та 4°C температурӑра 15 минут хушши 14 пин ҫаврӑм/мин центрифугӑланӑ. Метаболитсем пур супернатант типсе ҫитичченех пӑсланать. Метаболитсене 50 мкл 0,03% мӑйракаллӑ кислотӑра тепӗр хут ирӗлтернӗ, хутӑштарма ҫавӑрнӑ, унтан ҫӳп-ҫапа кӑларма центрифугӑланӑ.
Ҫӳлте ҫырса кӑтартнӑ пек метаболитсене кӑларӑр. Метаболомика тӗпчевӗсем валли ҫӳлти шыва пысӑк хӑватлӑ шӗвек хроматографи кӗленчине куҫармалла. Пакетлӑ эффектсене сирсе яма кашни пробӑна пӗр пек йышлӑ клеткӑсемпе имҫамлама ӑнсӑртлӑ имҫам протоколӗпе усӑ курӑр. Эпир AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50) ҫинче маларах пичетленнӗ тӗнчери метаболитсен пахалӑхлӑ хаклавне туса пӑхрӑмӑр. Хроматографи анализне тата пик лаптӑкӗн интеграцине MultiQuant 2.1 верси программипе (Applied Biosystems SCIEX) усӑ курса тунӑ.
Ҫук метаболит хакне хаклама 1000 ион шучӗпе усӑ курнӑ, кашни пробӑн ТИК-не вара кашни тупнӑ метаболитӑн нормализациленӗ пик лаптӑкне шутласа кӑларнӑ, ҫапла майпа пробӑна ӗҫлесе хатӗрленӗ чухне инструменталлӑ анализ кӗртнӗ улшӑнусене тӳрлетнӗ. TIC нормализациленнӗ хыҫҫӑн MetaboAnalystR(51) (стандартлӑ параметр) логарифмлӑ конвертаци тата автоматла норма йӗрӗсене масштаблама усӑ кураҫҫӗ. Эпир PCA-па веган R пакетӗпе усӑ курса тӗслӗхсен тӗсӗсем хушшинчи метаболом уйрӑмлӑхӗсене тӗпчекен анализ турӑмӑр, пациентсене тишкерме пайӑр редуцирлӑх анализӗпе усӑ куртӑмӑр. Уорд меслечӗпе усӑ курса ӑшӑ карттин дендрограммине туса тӗслӗхсем хушшинчи евклидовӑй хушша кластерлама усӑ курӑр. Эпир стандартизациленӗ метаболитсен йышлӑхӗ ҫинче лимма (52) меслечӗпе усӑ курса пӗтӗм клетка типӗпе микротавралӑхра дифференциаллӑ йышлӑ метаболитсене тупса палӑртрӑмӑр. Ӑнлантарӑва ансатлатас тесе эпир моделе палӑртма ушкӑн вӑтам параметрӗпе усӑ куратпӑр, микротавралӑхри клетка тӗсӗсене кашни ушкӑн пек шута илетпӗр (n = 6 ушкӑн); пӗлтерӗшлӗх тӗрӗслевӗ валли эпир кашни метаболитшӑн виҫӗ хутчен виҫрӗмӗр Суя репликацирен сыхланас тесе пациента лимма дизайнне чӑрмав вырӑнне кӗртрӗмӗр. Тӗрлӗ пациентсен хушшинчи метаболитсен уйрӑмлӑхӗсене тӗрӗслес тӗллевпе эпир лимма модельне пациентсене ҫирӗплетнӗ майпа тӳрлетрӗмӗр. Эпир Padj <0,05 (Бенджамини-Хохберг тӳрлетӗвӗ) клетка типӗпе микротавралӑх хушшинчи малтанах палӑртнӑ контрастӑн пӗлтерӗшне пӗлтеретпӗр.
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% пурнӑҫлӑх) усӑ курса вӑй-хал пуянлатнӑ хыҫҫӑн 10x 5′ген экспрессийӗн протоколӗпе усӑ курса пӗтӗмӗшле чӗрӗ шӑнтнӑ асцит тата шыҫӑ пробисем ҫинче пӗр клеткӑллӑ транскриптом секвенированине туса пынӑ. Пӗр пек шыҫӑсемпе асцитлӑ пилӗк тӗслӗхе тишкернӗ, анчах та пӗр шыҫӑ тӗслӗхӗн пурнӑҫлӑхӗ пӗчӗк пулни ӑна кӗртме чӑрмантарнӑ. Пациентсене нумай суйласа илме эпир кашни пациентӑн пробисене 10 хут хром контроллерӗн йӗрӗсенче пӗрлештертӗмӗр, асцитпа шыҫӑ вырӑнӗсене уйрӑммӑн анализларӑмӑр. Секвенировани хыҫҫӑн [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp мӑшӑрлӑ вӗҫӗ (PE), Квебек геномӗ; шыҫӑ тата асцит валли кашни клеткӑра вӑтамран 73 488 тата 41 378 вулав пулнӑ]], эпир CellSNP тата Vireo (53) (CellSNP ҫинче никӗсленсе) усӑ куртӑмӑр (CellSNP ҫинче никӗсленсе GRCh38 панӑ этем SNP (VCF) донор идентичноҫне уйӑрнӑ. уйӑрман клеткӑсене тата асцитпа шыҫӑ пробисем хушшинчи донорсем пек палӑртнӑ клеткӑсене шута илмесен (54). (2792 тата 4183 клетка шыҫӑран тата асцитран) анализ тума эпир igraph (57) Louvain кластеризацийӗпе усӑ куратпӑр, вӑл экспресси тӑрӑх кластер клеткисем патне ҫитичченхи дистанцие тӗпе хурать. клеткӑсем CD8A тата GZMA экспрессийӗпе палӑраҫҫӗ, рибосомӑллӑ белок экспрессийӗ пӗчӗк субкластерсене шута илмесен.
ПБМК-сене лейкоцитсене уйӑракан продуктсенчен (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент ҫӑра центрифугипе уйӑрнӑ. CD3 + клеткӑсене PBMC-ран CD3 шӑрҫисемпе (Miltenyi) уйӑрнӑ. МНА пур чухне е ҫук чухне CD3+ клеткисене пластинкӑпа ҫыхӑннӑ CD3 (5 мкг/мл), ирӗлекен CD28 (3 мкг/мл) тата IL-2 (300 Е/мл; Пролейкин) активизациленӗ. Сарӑлӑвӑн юлашки кунӗнче пурнӑҫлӑха (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) тата пролиферацие (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) юхӑм цитометрипе хакланӑ. Эффектор функцине 4 сехет хушши GolgiStop-па PMA (20 нг/мл) тата иономицин (1 мкг/мл) клеткӑсемпе стимуляцилесе хакламалла, ҫавӑн пекех CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) тата TNFα-флуоресцетиотианат (TCB) БД). qPCR тата ChIP клеткисене PMA (20 нг/мл) тата иономицин (1 мкг/мл) 4 сехет хушши стимуляцилемелле. ИФА супернатантне 4 сехет хушши ПМА (20 нг/мл) тата иономицин (1 мкг/мл) стимуляци умӗн тата хыҫҫӑн пухнӑ.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) меслечӗпе усӑ курса РНК уйӑрма производитель протоколне пӑхӑнӑр. Пробӑна пӗр евӗрлӗ тума QIAshredder (QIAGEN) усӑ курӑр. Комплементарлӑ ДНК (кДНК) синтезлама пысӑк хӑватлӑ РНК-ран кДНК комплектне (Thermo Fisher Scientific) усӑ курӑр. TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) программӑпа усӑ курса генсен экспрессине (производитель протоколӗпе килӗшӳллӗн) ҫак зондсемпе виҫме пулать: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427554079_m1 (AOX1) Hs02786624_g1 [глицеральдегид-3-фосфат оф Водород (GAPDH)] тата Hs01010726_m1 (SLC22A2). Пробӑсене StepOnePlus чӑн-чӑн вӑхӑтри ПЦР системипе (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) MicroAmp хӑвӑрт оптика 96 лункӑллӑ реакци пластинкинче (Applied Biosystems) MicroAmp оптика пленкипе ӗҫлеттернӗ. Кирек мӗнле Ct хакӗ те 35-рен пысӑкрах пулсан, ӑна тупмалли чикӗрен ҫӳлерех тесе шутлаҫҫӗ тата тупма май ҫук тесе паллӑ тӑваҫҫӗ.
ChIP-а малтан ҫырса кӑтартнӑ пек пурнӑҫлӑр (58). Кӗскен каласан, клеткӑсене формальдегидпа (юлашки концентраци 1,42%) имҫамланӑ та пӳлӗм температуринче 10 минут хушши инкубациленӗ. Пӑр ҫинче 10 минут хушши хушса панӑ шыҫӑ буферӗпе (25 мМ Hepes, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl тата 0,1% NP-40) усӑ курмалла, унтан иммунопреципитаци буферӗнче ҫырса кӑтартнӑ пек ҫӗнӗрен лартмалла (58 ). Унтан пробӑна ҫак циклсемпе ультрасасӑпа ҫутатнӑ: 10 цикл (20 1 ҫеккунтлӑ импульс) тата 40 ҫеккунтлӑ статикӑллӑ вӑхӑт. ChIP-сортлӑ иммуноглобулин G (Cell Signaling Technology; 1μl), гистон H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) тата SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) антителасене 4°CC температурӑра ҫӗр каҫа силлесе инкубацилемелле. А белок шӑрҫисене (Thermo Fisher Scientific) пробӑпа 4°C температурӑра 1 сехет хушши ҫемҫен силлесе инкубацилемелле, унтан ДНК-на пуянлатма хелекс шӑрҫисемпе (Bio-Rad) усӑ курмалла, белок ирӗлтерме протеиназа К (Thermo Fisher) усӑ курмалла. TNFα промоторне ПЦР мелӗпе тупса палӑртнӑ: малалла, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; пачах урӑхла, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp продукт). Ӳкерчӗксене Image Lab (Bio-Rad) компани туса кӑларнӑ тата ImageJ программӑпа усӑ курса шутласа кӑларнӑ.
Клетка культурин супернатантне ҫӳлте ҫырса кӑтартнӑ пек пухнӑ. Ҫакна палӑртассине ҫыннӑн TNFα ИФА-комплекчӗн (Invitrogen), ҫыннӑн IL-2 ИФА-комплекчӗн (Invitrogen) тата ҫыннӑн IFN-γ ИФА-комплекчӗн (Abcam) производителӗн процедурисемпе килӗшӳллӗн туса пынӑ. Производитель протоколӗпе килӗшӳллӗн, супернатант TNFα тата IL-2 тупма 1:100, IFN-γ тупма 1:3 шайра ирӗлтернӗ. 450 нм ҫинче абсорбцие виҫме EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) программӑпа усӑ курӑр.
ПБМК-сене лейкоцитсене уйӑракан продуктсенчен (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент ҫӑра центрифугипе уйӑрнӑ. CD3 + клеткӑсене PBMC-ран CD3 шӑрҫисемпе (Miltenyi) уйӑрнӑ. МНА пур чухне е ҫук чухне CD3+ клеткисене 3 кун хушши пластинкӑпа ҫыхӑннӑ CD3 (5 мкг/мл), ирӗлекен CD28 (3 мкг/мл) тата IL-2 (300 Е/мл; Пролейкин) препаратсемпе активизациленӗ. кунран клеткӑсене пуҫтарнӑ та 0,9% тӑварлӑ шывпа ҫуса тасатнӑ, унтан гранулӑна хӑвӑрт шӑнтнӑ. Клеткӑсен шутне юхӑм цитометрипе (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигураци) 123count eBeads меслечӗпе усӑ курса шутланӑ.
Ҫӳлте ҫырса кӑтартнӑ пек метаболитсене кӑларӑр. Типӗтнӗ экстракта 4000 клетка эквиваленчӗ/мкл концентраципе ҫӗнӗрен хатӗрленӗ. Тӗслӗхе каялла ҫаврӑннӑ фазӑллӑ хроматографипе (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) тата CORTECS T3 колонкӑпа (2,1×150 мм, пайӑрка калӑпӑшӗ 1,6-мкм, шӑтӑк калӑпӑшӗ 120-Å; #186008500, Waters) мелӗпе тишкермелле. Полярлӑ масс-спектрометр (6470, Agilent), унта электроспрей ионизацийӗ лайӑх режимра ӗҫлет. А куҫса ҫӳрекен тапхӑрта 0,1% кӑткӑс кислоти (H2O-ра), куҫакан В тапхӑрта 90% ацетонитрил, 0,1% кӑткӑс кислоти. LC градиент 100% А валли 0-2 минут, 99% В валли 2-7,1 минут, 99% В валли 7,1-8 минут. Унтан 3 минут хушши 0,6 мл/мин юхӑм хӑвӑртлӑхӗпе куҫакан А фазӑпа колонкӑна тепӗр хут шайлаштармалла. . Юхӑм хӑвӑртлӑхӗ 0,4 мл/мин, колонка камерине 50°C таран ӑшӑтаҫҫӗ. MNA-н таса хими стандарчӗпе (M320995, Toronto Research Chemical Company, Ҫурҫӗр Йорк, Онтарио, Канада) усӑ курса тытса тӑмалли вӑхӑта (RT) тата трансформацие (RT = 0,882 минут, трансформаци 1 = 137→94,1, трансформаци 2 = 137→92 , Конверси = 33→77) палӑртмалла. Виҫӗ куҫӑм та тӗрӗс тытса тӑмалли вӑхӑтра пулса тухсан, 1-мӗш куҫӑмпа спецификӑна тивӗҫтерес тӗллевпе шутласа кӑларма усӑ кураҫҫӗ. MNA (Toronto Research Chemical Company) стандартлӑ йӗрне 0,1, 1,0, 10 тата 100 нг/мл тата 1,0 тата 10 мкг/мл шӗвек стандартсем илме никӗс ирӗлчӗкне (1 мг/мл) ултӑ хутчен серийӗпе ирӗлтерсе тунӑ. Тупмалли чикӗ 1 нг/мл, линейнӑй хурав вара 10 нг/мл тата 10 мкг/мл хушшинче. ЖК/МС анализӗ валли икӗ микролитр проба тата стандарт кашни инъекцийӗпе усӑ кураҫҫӗ, анализ платформин стабильлӗхне тивӗҫтерес тесе кашни сакӑр инъекцире хутӑш пахалӑх тӗрӗслевӗн пробине ӗҫлеттереҫҫӗ. МНА-па имҫамланӑ пур клетка пробисен те МНА хуравӗсем анализӑн линейнӑй диапазонӗнче пулнӑ. Даннӑйсене анализлама MassHunter йышлӑ анализ программипе (v9.0, Agilent) усӑ курса тунӑ.
Иккӗмӗш ӑрури αFR-CAR конструкцине Song et al. (59). Кӗскен каласан, конструкцире ҫакӑн пек содержани пур: CD8a лидер йӗрки, этем αFR-спецификлӑ пӗр сӑнчӑрлӑ улшӑнакан фрагмент, CD8a шарнир тата трансмембранӑллӑ регион, CD27 клетка ӑшӗнчи домен тата CD3z клетка ӑшӗнчи домен. Пӗтӗм CAR йӗркине GenScript синтезланӑ, унтан трансдукци эффективлӑхне хаклама усӑ курнӑ GFP экспресси кассетинчен ҫӳлерехри иккӗмӗш ӑрури лентивирус экспресси векторне клонланӑ.
Лентивирус HEK293T клеткӑсене трансфекцилесе туса кӑлараҫҫӗ [Америка йышши культура пуххи (ATCC); 10% ӗне юн тымарӗ (FBS) тата 1% PenStrep хушнӑ Dulbecco компанийӗн модификациленӗ Eagle хутлӑхӗнче ӳстернӗ, CAR-GFP векторӗпе усӑ курнӑ тата упаковка плазмидисем (psPAX2 тата pMD2.G, Addgene) липофекци аминӗпе (Sigma-Aldrich) усӑ курнӑ. Вируслӑ супернатант трансфекци хыҫҫӑн 48 тата 72 сехетрен пуҫтарнӑ, фильтрланӑ та ультрацентрифугӑпа концентратланӑ. Концентратлӑ вирус супернатантне -80°C температурӑра трансдукци пуличчен упрамалла.
ПБМК-сене сывӑ донор лейкоцитӗсене уйӑракан продуктсенчен (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент ҫӑра центрифугипе уйӑраҫҫӗ. PBMC-ран CD8+ клеткӑсене уйӑрма лайӑх суйласа илӳллӗ CD8 микрошӑрҫисемпе (Miltenyi) усӑ курӑр. Т-клеткӑсене TransAct (Miltenyi) тата TexMACS хутлӑхра [Miltenyi; 3% ӑшӑпа инактивациленӗ этем юн тымарӗ, 1% PenStrep тата IL-2 (300 Е/мл) хушса панӑ]. Стимуляци хыҫҫӑн ҫирӗм тӑватӑ сехетрен Т-клеткӑсене лентивируспа (106 клеткӑна 10 мкл концентратлӑ вирус супернатанчӗ) трансдукциленӗ. 1-3 кунран Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) ҫинче трансдукциленӗ хыҫҫӑн клеткӑсен GFP экспрессине 30% кая мар трансдукци эффективлӑхне кӑтартма хакламалла.
CAR-T клеткисене Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep хушса) 24 сехет хушши ҫакӑн пек условисенче ӳстернӗ: имҫамламан, 250 мкМ аденозинпа е 10 мМ МНА имҫамланӑ. Малтанхи ӗҫ хыҫҫӑн CAR-T клеткисене PBS-па ҫуса тасатнӑ та 20 пин SK-OV-3 клеткӑпа пӗрлештернӗ [ATCC; 10% FBS тата 1% PenStrep хушнӑ McCoy 5A хутлӑхра (Sigma-Aldrich) 10 сехетре: эффекторпа мишень шайлашӑвне 1 хушса панӑ Immunocult хутлӑхра виҫӗ хутчен ӳстернӗ. SK-OV-3 клеткисене тата SK-OV-3 клеткисене digitalis сапонинпа (0,5 мг/мл; Sigma-Aldrich) лизланӑ, ҫавӑн пекех отрицательнӑй тата позитивлӑ контроль вырӑнне усӑ курнӑ. сехет хушши пӗрле ӳстернӗ хыҫҫӑн супернатант пухнӑ та лактатдегидрогеназӑна (LDH) производитель инструкцийӗ тӑрӑх виҫнӗ (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). LDH супернатантне LDH буферӗнче 1:50 шайра ирӗлтернӗ. Вӗлерӳ процентне ҫак формулӑпа виҫнӗ: вӗлерӳ процентӗ = тӳрлетӳ процентӗ / чи пысӑк вӗлерӳ шайӗ х 100%, кунта тӳрлетӳ процентӗ = пӗрлехи культура-Т-клеткӑсем кӑна, тата чи пысӑк вӗлерӳ шайӗ = лайӑх контроль-отрицательнӑй контроль.
Текстра е материалсемпе меслетсенче ҫырса кӑтартнӑ пек, статистика анализӗ валли GraphPad Prism 8, Microsoft Excel е R v3.6.0 программӑсемпе усӑ курӑр. Пӗр пациентран нумай проба пухнӑ пулсан (сӑмахран, асцит тата шыҫӑ), эпир мӑшӑрлӑ t-тестпа усӑ куратпӑр е пациента линейнӑй е пӗтӗмлетнӗ модельре ӑнсӑртлӑ эффект пек кӗртетпӗр. Метаболомика анализӗ валли пӗлтерӗшлӗх тӗрӗслевне виҫӗ хутчен туса пыраҫҫӗ.
Ҫак статья валли хушма материалсем илме http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
Ку вӑл — уҫӑ доступлӑ статья, ӑна Creative Commons Attribution-Non-Commercial License условийӗсемпе салатаҫҫӗ, вӑл кирек мӗнле хатӗрпе те усӑ курма, салатма тата ҫӗнӗрен кӑларма май парать, анчах та юлашки хут коммерциллӗ усӑ валли мар тата малтанхи ӗҫ тӗрӗс пулни ҫинчен калакан никӗс пулсан. Ссылка.
Асӑрхаттару: Эпир сире хӑвӑрӑн электронлӑ почта адресне ҫеҫ ыйтатпӑр, ҫапла вара эсир страницӑна сӗнекен ҫын эсир электронлӑ почтӑна курасшӑн пулнине тата вӑл спам маррине пӗлтӗр. Эпир нимӗнле электронлӑ почта адресӗсене те ҫырса илместпӗр.
Ку ыйтупа эсир хӑна пулнине тӗрӗслеме тата спам автоматла ярса пама чарма усӑ кураҫҫӗ.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Г. Захариас (Лорен Г. Захариас), Эбигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Брэд Х. Нельсон (Брэд Х. Нельсон), Ральф Дж. Дерард Беллни (Р.Р.Бернис), Дж. Дер. Джонс (Рассел Г. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
МНА Т-клеткӑсен иммунлӑхне пусарма пулӑшать тата этем ракне сиплемелли иммунотерапин потенциаллӑ тӗллевӗ пулса тӑрать.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Г. Захариас (Лорен Г. Захариас), Эбигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Брэд Х. Нельсон (Брэд Х. Нельсон), Ральф Дж. Дерард Беллни (Р.Р.Бернис), Дж. Дер. Джонс (Рассел Г. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
МНА Т-клеткӑсен иммунлӑхне пусарма пулӑшать тата этем ракне сиплемелли иммунотерапин потенциаллӑ тӗллевӗ пулса тӑрать.
©2021 Америка наукӑна аталантарас енӗпе ӗҫлекен ассоциацийӗ. пур правӑсем те сыхланса юлнӑ. AAAS — HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef тата COUNTER компанисен партнерӗ. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.