Секреторлӑ ҫул ҫинче белок сортировки клеткӑсен компартментализацине тата гомеостаза тытса тӑма питӗ кирлӗ. Хуппи урлӑ сортировка тунисӗр пуҫне, секреторлӑ транспорт процесӗнче кинезин сортировкинче липидсен ролӗ — тахҫантанпах пыракан тӗп ыйту, ӑна хальлӗхе хуравлама май килмен-ха. Кунта эпир 3D пӗр вӑхӑтрах нумай тӗслӗ пысӑк ҫивӗчлӗхлӗ чӑн-чӑн вӑхӑтри ӳкерчӗксем тӑватпӑр, ҫакна in vivo ҫирӗплетсе паратпӑр: ҫӗнӗрен синтезланӑ гликозилфосфатидилинозитолпа иммобилизациленӗ питӗ вӑрӑм керамид липид пайӗллӗ белоксем кластерланса ятарлӑ эндоплазмӑсен таса тухмалли вырӑнне уйӑрнӑ, вӑл трансмембранӑллӑ белоксем усӑ куракан белоксенчен уйрӑлса тӑрать. Унсӑр пуҫне, эпир ҫакна кӑтартатпӑр: эндоплазма ретикулумӗн мембранинчи керамидӑн сӑнчӑр тӑршшӗ ҫак сортировка селективлӑхӗшӗн питӗ кирлӗ. Пирӗн тӗпчев липид сӑнчӑрӗн тӑршшӗ тӑрӑх белок грузӗсене секреторлӑ ҫул ҫинчи суйласа илнӗ экспорт вырӑнӗсене уйӑрма пӗрремӗш тӳрӗ in vivo ҫирӗплетӳ парать.
Эукариот клеткисенче эндоплазма ретикулумӗнче (ЭР) синтезланӑ белоксене вара секреторлӑ ҫул урлӑ куҫарнӑ чухне вӗсене тивӗҫлӗ клеткӑллӑ вырӑна ҫитереҫҫӗ (1). Ҫиелти сийпе йӗркеленӗ сортировкӑсӑр пуҫне, хӑш-пӗр липидсем ятарлӑ мембрана доменӗсене, ятарлӑ белоксене (2-5) пӗрлештерсе, суйласа илнӗ тухмалли вырӑнсем пулса тӑма пултарасси пирки тахҫантанпах шухӑшланӑ (2-5). Анчах та ҫак липид никӗсӗ ҫинче пулма пултаракан механизма ҫирӗплетме тӳрӗ in vivo ҫирӗплетӳсем ҫук-ха. Ҫак тӗп ыйтӑва татса парас тесе эпир йӳҫекре гликозилфосфатидилинозитол (GPI) ҫирӗплетнӗ белоксем (GPI-APs) ER-ран мӗнле дифференциаллӑ экспортланнине тӗпчерӗмӗр. GPI-APs — липидпа ҫыхӑннӑ клетка ҫийӗнчи белоксен тӗрлӗ тӗсӗ ( 6, 7). GPI-AP — секретланӑ белок, вӑл плазма мембранин тулашри листовкисем ҫумне гликолипид пайӗ урлӑ ҫыпӑҫать (GPI якорь). Вӗсем GPI якӑрӗсене ER люменӗнчи консервативлӑ посттрансляциллӗ модификацисем пек йышӑнаҫҫӗ (8). Ҫыпӑҫтарнӑ хыҫҫӑн GPI-AP Гольджи аппарачӗ витӗр (5, 9) ER-ран плазма мембрани патне ҫитет. GPI якорьсем пурри GPI-AP-а трансмембранӑллӑ секретланӑ белоксенчен (ҫав шутра ытти плазма мембранин белокӗсенчен те) секреторлӑ ҫул тӑрӑх уйрӑм куҫарма май парать (5, 9, 10). Йӳҫӗ клеткисенче GPI-AP-сене эндоплазма ретикулумӗнчи ытти секретланӑ белоксенчен уйӑраҫҫӗ, унтан вӗсене сий белокӗн II комплексӗпе (COPII) чӗркенӗ хӑйне евӗрлӗ везикулӑсене пуҫтараҫҫӗ (6, 7). ER экспорт процесӗнчи ҫак классификаци процесӗн детерминанчӗсем паллӑ мар, анчах та ҫак механизм липидсем ыйтма пултарать тесе шутлаҫҫӗ, уйрӑмах GPI якорьӗн липид пайӗн структурӑллӑ ремоделированине (5, 8). Йӳҫекре GPI липидӗн ремоделированине GPI ҫыпӑҫнӑ хыҫҫӑнах пуҫлаҫҫӗ, нумай чухне вӑл керамида 26 углеродлӑ вӑрӑм сӑнчӑрлӑ тулнӑ ҫу кислотипе (C26:0) ҫыхӑнтарать (11, 12). С26 керамид — халиччен йӳҫек клеткисем туса кӑларакан тӗп керамид. Ӑна ER-ра синтезлаҫҫӗ, унӑн ытларах пайне COPII везикулӗсем урлӑ Гольджи аппарачне ӑсатаҫҫӗ (13). GPI-AP-ӑн ER экспортӗ ятарласа керамид синтезне малалла тӑсма ыйтать (14, 15), ҫавӑнпа та Гольджи аппарачӗнче керамид инозитол фосфат керамидне (IPC) куҫасси GPI якорь синтезӗнчен килет (16). Искусственнӑй мембранӑсемпе тунӑ биофизика тӗпчевӗсем питӗ вӑрӑм ацил сӑнчӑрлӑ керамидсем пӗрлешсе хӑйне евӗрлӗ физика характеристикиллӗ йӗркеллӗ доменсем тума пултарнине кӑтартнӑ (17, 18). Ҫак кӑтартусем ҫакӑн пек гипотезӑна илсе пыраҫҫӗ: C26 керамид тата C26 керамидлӑ GPI-AP хӑйсен физика характеристикисемпе усӑ курса йӗркеллӗ регионсене е ER мембранин липид таврашӗнчи регионсене пӗрлешеҫҫӗ. Вӑл ытларах кӗске тата тулман глицеролипидсенчен (С16:1 тата С18:1) тӑрать (19, 20). Ҫак регионсене ятарлӑ ER тухмалли вырӑнсем ҫине (ERES) суйласа илсе тимлӗх уйӑрӗҫ, унта керамидпа керамид никӗсӗ ҫинче тунӑ GPI-AP-а пӗр ятарлӑ COPII везикулӑра Гольджие пӗрле куҫарма пулать (5).
Ҫак ӗҫре эпир ҫак липид никӗсӗ ҫинче тунӑ механизма супер-разрешениллӗ конфокаллӑ чӑн-чӑн вӑхӑтри ӳкерчӗк микроскопийӗпе (SCLIM) усӑ курса тӳрремӗнех тӗрӗслерӗмӗр, вӑл — флуоресцентлӑ паллӑланӑ белоксене пӗр вӑхӑтрах сӑнама пултаракан чи ҫӗнӗ микроскопи меслечӗ.
Эпир малтанах SCLIM технологипе усӑ курса S. cerevisiae-ра ER-ран тухнӑ хыҫҫӑн трансмембранӑллӑ секретланӑ белоксенчен C26 керамид ушкӑнӗпе йӗркеллӗ GPI-AP-а мӗнле скрининг тунине малалла палӑртрӑмӑр. ER классификацине тӗрӗслес тӗллевпе эпир генетика тытӑмӗпе усӑ куртӑмӑр, вӑл ҫӗнӗрен синтезланӑ груз ERES-а in vivo кӗнине тӳрремӗнех курма пултарать (7, 23). Груз вырӑнне эпир C26 керамид никӗсӗ ҫинче симӗс флуоресцентлӑ белокпа (GFP) паллӑ тунӑ GPI-AP Gas1 тата ҫывӑх инфрахӗрлӗ флуоресцентлӑ белокпа (iRFP) паллӑ тунӑ трансмембранӑллӑ секретлӑ белок Mid2 суйласа илтӗмӗр, вӗсем иккӗшӗ те плазма мембрани ҫине тӗллев лартнӑ (24–26). sec31-1 температурӑна сисӗмлӗ мутантра ҫак икӗ груз галактозӑна аталантаракан промоторпа тата конститутивлӑ ERES маркерпа экспрессиленеҫҫӗ. Ҫав тери пысӑк температурӑра (37°C), мӗншӗн тесен sec31-1 мутаци COPII сийӗн Sec31 компоненчӗн COPII шӑтса тухассине тата ER экспортне чармалли функцине витӗм кӳрет, ҫӗнӗрен синтезланӑ груз ER-ра пухӑнать (23). Пӗчӗк температурӑна (24°C) сивӗтнӗ хыҫҫӑн sec31-1 мутант клеткисем секреторлӑ лаптӑкран тухнӑ, пухӑннӑ ҫӗнӗ синтетика грузне ER-ран кӑларма пуҫланӑ. CLIM визуализацийӗ ҫакна кӑтартнӑ: ҫӗнӗрен синтезланӑ Gas1-GFP тата Mid2-iRFP ытларахӑшӗ sec31-1 мутант клеткисен ER-ӗнче 37°C температурӑра инкубациленӗ хыҫҫӑн та пухӑннӑ, унтан 24°C температурӑра 5 минут хушши ирӗке тухнӑ (1-мӗш ӳкерчӗк). Mid2-iRFP пӗтӗм ER мембрани ҫинче сарӑлнӑран, Gas1-GFP вара ER мембранин татӑк-кӗсӗк лаптӑкӗнче пухӑннӑран вӗсен сарӑлӑвӗ пачах урӑхла (1-мӗш ӳкерчӗк, А-ран пуҫласа С таран тата S1 фильм). Унсӑр пуҫне, 1D ӳкерчӗкре кӑтартнӑ пек, Gas1-GFP кластерӗнче Mid2-iRFP ҫук. Ҫак кӑтартусем GPI-AP тата трансмембранӑллӑ белоксем тӗрлӗ ER мембрана регионӗсене малтанах уйрӑлнине кӑтартаҫҫӗ. Gas1-GFP кластерӗ mCherry COPII сийӗн Sec13 белокӗпе паллӑ тунӑ ятарлӑ ERES ҫумӗнче (1-мӗш ӳкерчӗк, E тата F, тата S1 фильм) (23).
sec31-1 клеткисем галактозӑпа пулакан секрецисене экспрессилеҫҫӗ, вӑрӑм ацил сыпӑкӗ (C26) керамид GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, симӗс) тата трансмембранӑллӑ белок Mid2-iRFP (TMP, кӑвак) тата ҫак Конструктивлӑ ERES маркировки Sec13-mCherry (E) 30°C валли магнитланнӑ минут, 24°C таран куҫарнӑ, 5 минутран SCLIM ӳкернӗ. (А-ран пуҫласа С таран) лаптӑкӑн пӗрлештернӗ е пӗр 2D ӳкерчӗкне (А), 10 z-секцирен тӑракан 2D проекци ӳкерчӗкне (В) е груз тата ERES маркерӗсен 3D клетка ҫурчӑмӑрӗн ӳкерчӗкне (С) кӑтартать. Шкала 1 мкм (А тата В). Масштаб единици 0,551 мкм (С). Gas1-GFP уйрӑм ER регионӗсенче е кластерсенче тупнӑ, Mid2-iRFP вара ER мембрани тӑрӑх сарӑлнӑ (C). (D) График ҫинче шурӑ стрелка йӗрӗ тӑрӑх (сулахайра) Gas1-GFP кластерӗнчи Gas1-GFP тата Mid2-iRFP флуоресценци хӑватлӑхне кӑтартнӑ. АУ, произвольная единица. (E тата F) таварпа ERES паллине пӗрлештерекен 3D ӳкерчӗке кӑтартаҫҫӗ. Gas1-GFP кластерӗсене ятарлӑ ERES ҫывӑхӗнче тупнӑ. Масштаб единици 0,551 мкм. (F) Шурӑ хытӑ стрелка ERES-па ҫыхӑннӑ Gas1-GFP кластерне палӑртать. Вӑтам тата сылтӑм панельсем пӗрлештернӗ пысӑклатнӑ 3D ӳкерчӗке тата суйласа илнӗ Gas1-GFP кластерӑн ҫаврӑннӑ ӳкерчӗкне кӑтартаҫҫӗ.
Gas1-GFP кластерӗпе ятарлӑ ERES хушшинчи тачӑ ҫыхӑну Gas1-GFP суйласа илнӗ ERES-а кӗме пултарнине кӑтартать, ку вара Mid2-iRFP ER-ран тухма усӑ куракан суйласа илме пултарнинчен уйрӑлса тӑрать. Ҫакна татса парас тесе эпир пӗр-икӗ таваршӑн кӑна ERES шайлашӑвне шутласа кӑлартӑмӑр (2-мӗш ӳкерчӗк, А-ран пуҫласа С таран). Эпир ытларах ERES (70%) пӗр тӗрлӗ груз кӑна пулнине тупрӑмӑр. 2С ӳкерчӗкри аялти ӳкерчӗкре ERES-ӑн икӗ типлӑ тӗслӗхне кӑтартнӑ, вӗсенче Gas1-GFP кӑна (1-мӗш ӳкерчӗк) е Mid2-iRFP кӑна (2-мӗш ӳкерчӗк) пур. Ун вырӑнне, ERES-ӑн 20% яхӑн пайӗнче пӗр лаптӑкра пӗр-пӗринпе ҫыхӑнса тӑракан икӗ груз пур. Хӑш-пӗр ERES-сенче (10%) икӗ тӗрлӗ груз пулнине тупса палӑртнӑ, анчах вӗсем пачах урӑх ҫӗрте уйрӑлса тӑнӑ. Ҫавӑнпа та ҫак статистика анализӗ ҫакна кӑтартать: ER экспортланӑ хыҫҫӑн GPI-AP Gas1-GFP тата трансмембранӑллӑ груз Mid2-iRFP тӗрлӗ ERES ҫине пайланаҫҫӗ (2D ӳкерчӗк). Ҫак сортировка эффективлӑхӗ унчченхи биохими анализӗпе (6) тата морфологи палӑртӑвӗпе (7) питӗ килӗшсе тӑрать. Эпир ҫавӑн пекех ERES-а кӗрекен карантинри груз хӑйне мӗнле тытнине сӑнама пултаратпӑр (2Е ӳкерчӗк тата S2 фильм). 2Е ӳкерчӗкре Gas1-GFP (3-мӗш панель) е Mid2-iRFP (4-мӗш панель) пӗчӗк пайӗ кӑна ERES-а пӗр енчен кӗнине тата уйрӑм лаптӑкра ларнине кӑтартнӑ. 2Е ӳкерчӗкри 5-мӗш панель Gas1-GFP тата Mid2-iRFP хӑш чухне пӗр ERES-ра тӗл пулнине кӑтартать, анчах вӗсем тӗрлӗ енчен кӗреҫҫӗ тата тӗрлӗ COPII пузырькисене кӑтартма пултаракан уйрӑм регионсенче пухӑнаҫҫӗ. Эпир ҫавӑн пекех ҫакна та ҫирӗплетрӗмӗр: C26 керамид ҫинче никӗсленнӗ GPI-AP Gas1 суйласа илнӗ ERES пек уйӑрӑлни тата классификацилени уйрӑм, мӗншӗн тесен тепӗр трансмембранӑллӑ секреци грузӗ, GFP-па паллӑ тунӑ плазма мембранин Axl2 белокӗ (27 ), Mid2-iRFP евӗрлӗ тыткаларӑш кӑтартать. (S1 ӳкерчӗк тата S3 фильм). Ҫӗнӗрен синтезланӑ Axl2-GFP ER мембрани урлӑ Mid2-iRFP пек сарӑлать (S1, А тата В ӳкерчӗксем), тата ытларах ERES-ра Mid2-iRFP-па пӗрле локализациленет (S1 ӳкерчӗк, B-ран пуҫласа D таран). 1-мӗш ӳкерчӗкри 1-мӗшпе 2-мӗш панельсем. S1C ERES-ӑн икӗ типлӑ тӗслӗхне кӑтартать, унта икӗ трансмембранӑллӑ груз пӗр-пӗрин ҫине ӳкеҫҫӗ. Ҫакӑн пек чухне икӗ тавар та ERES-а пӗрле кӗреҫҫӗ (S1E ӳкерчӗк, 3-мӗш панель тата S3-мӗш фильм).
Галактозӑна аталантаракан секрецисене экспрессилекен sec31-1 клеткисене, Gas1-GFP (GPI-AP, симӗс) тата Mid2-iRFP (TMP, кӑвак) тата конститутивлӑ ERES маркировки Sec13-mCherry (ERES, пурпур) 37 °C температурӑра 30 минут хушши инкубациленӗ хыҫҫӑн 24 °C температурӑра инкубациленӗ хыҫҫӑн 24 °C ҫине куҫарнӑ, иона секрет ҫине куҫарнӑ, SCLIM-па 20 минутран. (А-ран пуҫласа С таран) 2D проекци ӳкерчӗкӗсем (А; масштаб йӗрӗ, 1 мкм) е 3D клетка ҫурчӑмӑрӗн ӳкерчӗкӗсем (В тата С; масштаб единици, 0,456 мкм) груз тата ERES-па паллӑ тунӑ 10 z-секци. (B) ӳкерчӗкри аялти панель тата (C) ӳкерчӗкри ӳкерчӗксене ERES (кӑвак) [Gas1-GFP (кӑвак) тата Mid2-iRFP (ҫутӑ кӑвак)] ҫинчи таварсене ҫеҫ кӑтартма ӗҫлесе хатӗрленӗ ӳкерчӗксене кӑтартаҫҫӗ. (C) Уҫӑ стрелка: ERES пӗр груз ҫеҫ илсе ҫӳрет (1-4). Сӑрӑ стрелка: ERES уйрӑм груз тытать (5). Шурӑ ҫирӗп стрелка: ERES, унта пӗрле вырнаҫнӑ груз пур. Аялта: суйласа илнӗ пӗр ERES-ра Gas1-GFP (1) е Mid2-iRFP (2) кӑна пур. Масштаб, 100 нм. (D) (C) ӳкерчӗкре ҫырса кӑтартнӑ фотомикрографӑн виҫи. Пӗр груз кӑна (Gas1-GFP е Mid2-iRFP), уйрӑм груз тата пӗр-пӗринпе ҫыхӑнса тӑракан груз пур ERES-ӑн вӑтам процентӗ. Виҫӗ никама пӑхӑнман экспериментра 54 клеткӑра n=432. Йӑнӑш йӗрӗ = SD. Икӗ енлӗ мӑшӑрланман t-тест. *** Р = 0,0002. (Е) (С) паллӑпа паллӑ тунӑ карантинри грузӑн суйласа илнӗ ERES-ӗн 3D ӳкерчӗкӗ. Gas1-GFP (симӗс) (3) е Mid2-iRFP (кӑвак) (4) пӗр енчен ERES (кӑвак) кӗрет те ERES ӑшӗнчи пӗчӗк лаптӑкпа ҫеҫ чикӗленет. Хӑш чухне икӗ тӗрлӗ груз та пӗр ERES-а (5) пӗр енчен кӗреҫҫӗ те ERES ӑшӗнчи уйрӑм лаптӑкра чикӗленеҫҫӗ. Масштаб, 100 нм.
Унтан эпир ER мембранинче пур вӑрӑм ацил сӑнчӑрлӑ керамид (C26) Gas1-ӑн суйласа илнӗ ERES-а ятарлӑ кластеризацине тата сортировкине ертсе пырать текен гипотезӑна тӗрӗслерӗмӗр. Ҫак тӗллевпе эпир GhLag1 модификациленӗ дрожжи штаммӗпе усӑ куртӑмӑр, унта икӗ эндогенлӑ керамид синтазине Lag1 тата Lac1 GhLag1 (ҫӑмӑн Lag1 гомологӗ) улӑштарнӑ, ҫакӑ вара тискер типрен кӗскерех клетка мембраниллӗ Ceramide штаммлӑ дрожжи штаммне туса хунӑ (3А ӳкерчӗк) (28-мӗш ӳкерчӗк). Масс-спектрометри (МС) анализӗ ҫакна кӑтартнӑ: тискер йышши штаммсенче пӗтӗмӗшле керамидӑн 95% питӗ вӑрӑм (C26) сӑнчӑрлӑ керамид, GhLag1-ре вара 85% керамид питӗ вӑрӑм (C18 тата C16). ), керамидӑн 2% кӑна питӗ вӑрӑм (C26) сӑнчӑрлӑ керамид. Хальлӗхе GhLag1 мембранинче C18 тата C16 керамидсем тупнӑ тӗп керамидсем пулсан та, MS анализӗ GhLag1 штаммӗнче экспрессиленӗ Gas1-GFP GPI якорьӗнче C26 керамид пуррине ҫирӗплетнӗ, вӑл тискер йышши липидсемпе танлашать. Пахалӑхӗ пӗр пекех (3А ӳкерчӗк) (26). Ҫавӑнпа та ку вӑл Cwh43 керамид ҫӗнетекен фермент C26 керамидшӑн питӗ суйласа илнине пӗлтерет, 26-мӗш ӳкерчӗкре кӑтартнӑ пек, вӑл GhLag1 штаммӗнчи C26 керамидӑн пӗчӗк виҫинчен GPI якорьне ытларах кӗртет. S2 (29). Апла пулин те, GhLag1 клетка мембранинче, тӗпрен илсен, C18-C16 керамид кӑна, Gas1-GFP-ра вара C26 керамид пур-ха. Ҫак факт ҫак штамма ЭР-ри мембранӑллӑ керамидӑн ацил сӑнчӑрӗн тӑршшӗн ыйтӑвне ятарласа татса памалли идеаллӑ хатӗр туса хурать. Класс тата сортировка гипотезӑллӑ ролӗ. Унтан эпир малтанах C26 Gas1-GFP температурӑна сисӗмлӗ sec31-1 мутант аллелӗпе GhLag1-ра кластерсенче пухӑнма пултарнине йӑлана кӗнӗ флуоресценци микроскопийӗ урлӑ тӗпчерӗмӗр, унта ER мембранинче Ceramide вӑрӑм (C18-C16) сӑнчӑр кӑна пур (3-мӗш ӳкерчӗк). Эпир sec31-1-ре Gas1-GFP ытларах пайӗ кластерсенче пухӑннине асӑрхарӑмӑр, ҫав вӑхӑтрах sec31-1 GhLag1-ри Gas1-GFP вӑрӑм (C18-C16) вӑрӑм керамид ER мембранипе тӗпрен илсен кластерланман тата пӗтӗм ER мембранинче сарӑлнӑ. Тӗрӗсрех каласан, C26 керамид ҫинче никӗсленнӗ кластеризаци ятарлӑ ERES-па тачӑ ҫыхӑннӑран (1-мӗш ӳкерчӗк), эпир малалла ҫак процесс ER экспорт белокӗн механизмӗн функцине те явӑҫтарма пултарнине тӗпчерӗмӗр. GPI-AP ER экспортӗ валли ятарлӑ COPII системипе усӑ курать, ӑна Ted1′s GPI якорьӗн гликан пайӗн структурӑллӑ ремоделированийӗ активлӑн йӗркелесе тӑрать (30, 31). Рекомбинантлӑ GPI-гликана вара трансмембранӑллӑ груз рецепторӗн p24 комплексӗ йышӑнать, вӑл вара Lst1-а суйласа илет, вӑл вара COPII груз ҫыхӑнӑвӗн тӗп субединицин Sec24 ятарлӑ изоформи пулса тӑрать, GPI-AP-пуян COPII йӗркелет. Везикулсем кирлӗ (31-33). Ҫавӑнпа та эпир ҫак пӗр белоксен (p24 комплекс компоненчӗ Emp24, GPI-гликан ремоделировани ферментӗ Ted1 тата ятарлӑ COPII субединици Lst1) sec31-1 мутант штаммӗпе пӗрлештернӗ икӗ хутлӑ мутант туса хатӗрлерӗмӗр те вӗсене тӗпчерӗмӗр. Эпир sec31-1emp24Δ тата sec31-1ted1Δ секцисенче Gas1-GFP ытларах кластерланманнине тата ER мембрани тӑрӑх сарӑлнине асӑрхарӑмӑр, ҫакна маларах sec31-1 GhLag1-ра курнӑччӗ, sec31-1lst1Δ-ра вара Gas1-GFP Like sec31-111-ра. Ҫак кӑтартусем ҫакна кӑтартаҫҫӗ: ER мембранинче C26 керамид пуррисӗр пуҫне, Gas1-GFP кластеризацийӗ p24 комплекспа та ҫыхӑнмалла, ҫавӑнпа та ӑна ятарлӑ Lst1 рекрутингӗ кирлӗ мар. Унтан эпир ER мембранинчи керамидӑн сӑнчӑр тӑршшӗ Gas1-GFP p24-па ҫыхӑнассине йӗркелеме пултарнине тӗпчерӗмӗр. Анчах та эпир ҫакна тупрӑмӑр: мембранӑра C18-C16 керамид пурри p24 комплекспа реконструкциленӗ GPI-гликансене (S3 тата S4, А тата В сӑнӳкерчӗксем) е GPI-AP-па ҫыхӑннине тата GPI-AP-а экспортланине витӗм кӳмест. пултарулӑх. COPII Lst1 подтипне илӗр (S4C ӳкерчӗк). Ҫавӑнпа та C26 керамидран килекен кластеризаци тӗрлӗ ER экспорт белок механизмӗсемпе белок хутшӑнӑвӗсене ыйтмасть, анчах та липид тӑршшӗпе ӗҫлекен альтернативлӑ сортировка механизмне пулӑшать. Унтан эпир ER мембранинчи керамид ацил сӑнчӑрӗн тӑршшӗ Gas1-GFP-на суйласа илнӗ ERES пек эффективлӑ классификацилеме пӗлтерӗшлӗ-и тесе тишкертӗмӗр. Кӗске сӑнчӑрлӑ керамидлӑ GhLag1 штаммӗнчи Gas1 ER-ран тухса плазма мембранине кӗнӗрен (S5 ӳкерчӗк), эпир ҫапла шутлатпӑр: енчен те сортировка керамид ацил сӑнчӑрӗн тӑршшӗпе ҫыхӑннӑ пулсан, GhLag1 штаммӗнчи Gas1-а урӑх еннелле ҫавӑрма тата хӗреслеме пулать. Пӗр пек мембранӑллӑ ERES таварӗсем.
(A) GhLag1 клетка мембранинче ытларах кӗскерех C18-C16 керамидсем пур, ҫав вӑхӑтрах Gas1-GFP GPI якорьӗнче тискер йышши клеткӑсенчи пекех C26 IPC пур. Ҫӳлте: тискер йышши (Wt) тата GhLag1p штаммсен клетка мембранинчи керамидӑн ацил сӑнчӑрӗн тӑршшӗне масс-спектрометрипе (MS) анализ туни. Даннӑйсем пӗтӗмӗшле керамидӑн процентне кӑтартаҫҫӗ. Виҫӗ никама пӑхӑнман экспериментӑн вӑтам кӑтартӑвӗ. Йӑнӑш йӗрӗ = SD. Икӗ енлӗ мӑшӑрланман t-тест. **** Р ＜0,0001. Аялти панель: тискер тип тата GhLag1p штаммсенче экспрессиленӗ Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI якорьӗнче пур IPC ацил сӑнчӑрӗн тӑршшӗн MS анализӗ. Даннӑйсем пӗтӗмӗшле IPC сигналӗн процентне кӑтартаҫҫӗ. Пилӗк никама пӑхӑнман экспериментӑн вӑтам кӑтартӑвӗ. Йӑнӑш йӗрӗ = SD. Икӗ енлӗ мӑшӑрланман t-тест. ns, пӗлтерӗшлӗ мар. Р = 0,9134. (B) Галактозӑпа индуцированнӑй Gas1-GFP экспрессилекен sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ тата sec31-1lst1Δ клеткисен флуоресценци микрографийӗсене 37°C температурӑра 30 минут хушши инкубациленӗ те флуоресценцие чакарнӑ 24°C хыҫҫӑн микроскоп. Шурӑ стрелка: ER Gas1-GFP кластерӗ. Уҫӑ стрелка: кластерсӑр Gas1-GFP пӗтӗм ER мембрани ҫинче сарӑлнӑ, ҫакӑ ER характерлӑ ядерлӑ ҫаврашка тӗсне кӑтартать. Шкала, 5 мкм. (C) (B) ӳкерчӗкре ҫырса кӑтартнӑ фотомикрографӑн виҫи. Пунктатлӑ Gas1-GFP структурӑллӑ клеткӑсен вӑтам процентӗ. Виҫӗ никама пӑхӑнман экспериментра n≥300 клетка. Йӑнӑш йӗрӗ = SD. Икӗ енлӗ мӑшӑрланман t-тест. **** Р ＜0,0001.
Ҫак ыйтӑва тӳрремӗнех татса парас тесе эпир GhLag1-ри Gas1-GFP тата Mid2-iRFP-сен SCLIM визуализацине sec31-1 температурӑна сисӗмлӗ мутант аллелӗпе туса пӑхрӑмӑр (4-мӗш ӳкерчӗк тата S4 фильм). ER 37°C температурӑра тытса тӑнӑ хыҫҫӑн тата унтан 24°C температурӑра кӑларнӑ хыҫҫӑн ҫӗнӗрен синтезланӑ Gas1-GFP ытларах пайӗ кластерланман тата ER мембрани тӑрӑх сарӑлман, ҫакна йӑлана кӗнӗ микроскопсемпе сӑнанӑ (4-мӗш ӳкерчӗк, А тата В). Унсӑр пуҫне, ERES-ӑн пысӑк пайӗ (67%) унта пӗрле вырнаҫнӑ икӗ тӗрлӗ груза кӗртет (4D ӳкерчӗк). 4С ӳкерчӗкри 1-мӗшпе 2-мӗш панельсенче ERES-ӑн икӗ типлӑ тӗслӗхне кӑтартнӑ, вӗсенче Gas1-GFP тата Mid2-GFP пӗр-пӗринпе ҫыхӑнса тӑраҫҫӗ. Унсӑр пуҫне, икӗ таварне те пӗр ERES-а илнӗ (4Е ӳкерчӗк, 3-мӗш панель тата S4 фильм). Ҫавӑнпа та пирӗн результатсем ҫакна кӑтартаҫҫӗ: ER мембранинчи керамид ацил сӑнчӑрӗн тӑршшӗ ER белокӗн агрегацийӗпе классификацийӗн пӗлтерӗшлӗ детерминанчӗ пулса тӑрать.
Sec31-1 GhLag1 клеткисем, галактозӑпа пулакан секретсене, Gas1-GFP (GPI-AP, симӗс) тата Mid2-iRFP (TMP, кӑвак) тата конститутивлӑ ERES-па паллӑ тунӑ Sec13-mCherry (ERES, хӗрлӗ) экспрессилеҫҫӗ, 37°C температурӑра инкубацилеҫҫӗ. минут хушши ҫапла тӑвӑр, 24°C таран антарӑр та секретсене кӑларӑр, 20 минутран вара SCLIM-па ӳкерӗр. (А-ран пуҫласа С таран) 2D проекци ӳкерчӗкӗсем (А; масштаб йӗрӗ, 1 мкм) е 3D клетка ҫурчӑмӑрӗн ӳкерчӗкӗсем (В тата С; масштаб единици, 0,45 мкм) 10 z-секцирен, вӗсене грузпа тата ERES-па палӑртнӑ. (B) ӳкерчӗкри аялти панель тата (C) ӳкерчӗкри ӳкерчӗксене ERES (кӑвак) [Gas1-GFP (кӑвак) тата Mid2-iRFP (ҫутӑ кӑвак)] ҫинчи таварсене ҫеҫ кӑтартма ӗҫлесе хатӗрленӗ ӳкерчӗксене кӑтартаҫҫӗ. (C) Шурӑ тултарнӑ стрелка: ERES, таварсем пӗр-пӗринпе ҫыхӑнса тӑраҫҫӗ. Уҫӑ стрелка: ERES-ра пӗр япала кӑна. Аялти панель: Суйласа илнӗ ERES-ра (C) паллӑ тунӑ пӗр-пӗринпе ҫыхӑнса тӑракан таварсем (1 тата 2) пур. Масштаб, 100 нм. (D) (C) ӳкерчӗкре ҫырса кӑтартнӑ фотомикрографӑн виҫи. sec31-1 тата sec31-1 GhLag1 агрегачӗсенче пӗр груз кӑна (Gas1-GFP е Mid2-iRFP) кӗрет, уйрӑм груз тата пӗр-пӗринпе ҫыхӑнса тӑракан груз валли ERES вӑтам процентӗ. Виҫӗ никама пӑхӑнман экспериментра 54 клеткӑра n = 432 (sec31-1) тата 47 клеткӑра n = 430 (sec31-1 GhLag1). Йӑнӑш йӗрӗ = SD. Икӗ енлӗ мӑшӑрланман t-тест. *** Р = 0,0002 (сек31-1) тата ** Р = 0,0031 (сек31-1 GhLag1). (Е) 3D ӳкерчӗк суйласа илнӗ ERES-ӑн пӗр-пӗрин ҫине ӳкекен грузпа (3) (C) паллӑ тунӑ. Gas1-GFP (симӗс) тата Mid2-iRFP (кӑвак) ERES (кӑвак) патне пӗр енчен ҫывхараҫҫӗ те пӗр ERES чикӗленӗ лаптӑкра тӑраҫҫӗ. Масштаб, 100 нм.
Ку тӗпчев липидсем ҫинче никӗсленнӗ белок грузӗсене секреторлӑ ҫул ҫинче суйласа илнӗ экспорт вырӑнӗсене уйӑрнине in vivo тӳрремӗнех кӑтартса парать тата классификаци селективлӑхӗшӗн ацил сӑнчӑрӗн тӑршшӗ мӗн тери пӗлтерӗшлӗ пулнине уҫса парать. SCLIM ятлӑ хӑватлӑ та ҫӗнӗлле микроскопи меслечӗпе усӑ курса эпир ҫӗнӗрен синтезланӑ Gas1-GFP (питӗ вӑрӑм ацил сӑнчӑрлӑ (C26) керамид липид пайӗллӗ пысӑк плазма мембранин GPI-AP) йӳҫекре кӑтартрӑмӑр) (1-мӗш ӳкерчӗк). Унсӑр пуҫне, ҫак икӗ тӗрлӗ тавар тӗрлӗ ERES-а суйласа илсе кӗрет (2-мӗш ӳкерчӗк). Мембранӑри клетка керамидӗн ацил сӑнчӑрӗн тӑршшӗ C26-ран C18-C16 таран чакать, Gas1-GFP кластерӗ уйрӑм ER регионне пӑсӑлать, Gas1-GFP вара ҫав ERES урлӑ трансмембранӑллӑ белокпа пӗрле ER-ран тухма куҫать (3-мӗш тата 3-мӗш ӳкерчӗксем). 4).
GPI-AP ER-ран тухма ятарлӑ белок механизмӗпе усӑ курать пулин те, эпир C26 керамидран килекен уйрӑлу ERES специализацине илсе пыма пултаракан дифференциаллӑ белок хутшӑнӑвӗсем ҫине шанманнине тупрӑмӑр (S4 тата S5 сӑнӳкерчӗксем). Ун вырӑнне пирӗн тупӑшусем липидсем ҫинче никӗсленнӗ белоксен кластеризацийӗпе тата каярахпа ытти грузсене кӑларса пӑрахнипе ҫыхӑннӑ альтернативлӑ классификаци механизмне ҫирӗплетеҫҫӗ. Пирӗн сӑнавсем ҫакна кӑтартаҫҫӗ: ятарлӑ ERES-па ҫыхӑннӑ Gas1-GFP регионӗнче е кластерта трансмембранӑллӑ секретланӑ Mid2-iRFP белок ҫук, ҫакӑ вара C26 керамидран килекен GPI-AP кластерӗ вӗсене тивӗҫлӗ ERES-а кӗме пулӑшассине, ҫав вӑхӑтрах трансмембранӑллӑ секретсене кӑларса пӑрахассине пӗлтерет. Унпа танлаштарсан, ER мембранинче C18-C16 керамидсем пурри GPI-AP-а регионсем е кластерсем йӗркелеме хистемест, ҫавӑнпа та вӗсем пӗр ERES-а трансмембранӑллӑ секретланӑ белоксене кӑларса пӑрахмаҫҫӗ е улӑштармаҫҫӗ (3 тата 4-мӗш сӑнӳкерчӗксем). . Ҫавӑнпа та эпир C26 керамид уйрӑм ERES-па ҫыхӑннӑ белоксен кластеризацине ҫӑмӑллатса уйӑрассине тата классификацие ертсе пынине сӗнетпӗр.
Ҫак C26 керамидран килекен кластеризацие ятарлӑ ER лаптӑкне мӗнле ҫитермелле? Мембранӑллӑ керамидӑн айккинелле уйрӑлма хӑнӑхни GPI-AP тата C26 керамидсене кӗскерех те тулман глицеролипидсемлӗ ER мембранӑн йӗркесӗррех липид хутлӑхӗнче пӗчӗк те самантрах йӗркеленӗ липидсем туса хума пултарать. Пахалӑх кластерӗсем (17, 18). Ҫак пӗчӗк вӑхӑтлӑх кластерсем p24 комплекспа ҫыхӑннӑ хыҫҫӑн пысӑкрах, ҫирӗпрех кластерсем пулса тӑма пултараҫҫӗ (34). Ҫакӑнпа килӗшӳллӗн эпир C26 Gas1-GFP p24 комплекспа хутшӑнса пысӑкрах курӑнакан кластерсем йӗркелеме кирлине кӑтартрӑмӑр (3-мӗш ӳкерчӗк). p24 комплексӗ — йӳҫекре тӑватӑ тӗрлӗ p24 трансмембранӑллӑ белокран тӑракан гетерозиготӑллӑ олигомер (35), вӑл нумай валентлӑ ҫыхӑнӑва тивӗҫтерет, ҫакӑ вара пӗчӗк GPI-AP кластерӗсене хӗреслӗ ҫыхӑнтарма пултарать, ҫавна май пысӑкрах стабильлӗ кластер пулса тӑрать (34). GPI-AP-сен белок эктодоменӗсем хушшинчи хутшӑну та вӗсен агрегацине пулӑшма пултарать, ҫакна вӗсем сӗтпе ӳстерекен чӗрчунсен поляризациленӗ эпителий клеткисенче Гольджи транспорчӗ вӑхӑтӗнче кӑтартнӑ (36). Анчах та ER мембранинче C18-C16 керамид пулсан, p24 комплекс Gas1-GFP-па ҫыхӑнсан, пысӑк уйрӑм кластерсем пулмаҫҫӗ. Тӗп механизмӗ вӑрӑм ацил сӑнчӑрлӑ керамидӑн уйрӑм физикӑпа хими характеристикисенчен килет. Искусствӑлла мембранӑсен биофизика тӗпчевӗсем ҫакна кӑтартаҫҫӗ: вӑрӑм (C24) тата кӗске (C18-C16) ацил сӑнчӑрлӑ керамидсем фазӑсене уйӑрма пултараҫҫӗ пулин те, вӑрӑм ацил сӑнчӑрлӑ керамидсем (C24) кӑна пленкӑна ҫӗнӗрен йӗркелеме пысӑк авӑнчӑклӑхпа пленка авӑнӑҫне пулӑшма пултараҫҫӗ. Пӗр-пӗрин ҫине пӑхса (17, 37, 38). TMED2-н трансмембранӑллӑ спиралӗ, Emp24-ӑн этем гомологӗ, цитоплазма лобулисенче C18 керамид никӗсӗ ҫинче тунӑ сфингомиелинпа суйласа хутшӑннине кӑтартнӑ (39). Молекулярлӑ динамика (МД) моделӗсемпе усӑ курса эпир C18 тата C26 керамидсем иккӗшӗ те Emp24 трансмембранӑллӑ спираль цитоплазма лобулисем тавра пухӑннине тупрӑмӑр, вӗсен пӗр пек преференцисем пур (S6 ӳкерчӗк). Ҫакна та палӑртмалла: ҫакӑ Emp24 трансмембранӑллӑ спираль мембранӑри липидсен асимметриллӗ валеҫӗвне илсе пыма пултарнине кӑтартать. Ку вӑл — сӗтпе ӳстерекен чӗрчунсен клеткисем ҫинче никӗсленнӗ юлашки кӑтарту. Ҫакӑн пек МД моделӗсем те эфир липидӗсем пуррине кӑтартаҫҫӗ (40) . Ҫавӑнпа та эпир ER26-ӑн икӗ пайӗнчи C26 керамид вырӑнта пуянланнӑ тесе шутлатпӑр. Ҫутӑ лобулисенчи GPI-AP нумай валентлӑ p24-па тӳрремӗнех ҫыхӑнсан тата цитоплазма лобулисенче p24 тавра C26 керамид пухӑнсан, вӑл унпа пӗрле пулакан белоксен агрегацине тата мембрана авӑнчӑкне пӳрнесем урлӑ йӗркелеме пулӑшать (41), ҫавна май GPI-AP ERES юнашар уйрӑм регионсене уйрӑлать, вӗсем те пысӑк кукӑр регионсене пулӑшаҫҫӗ ER мембрани (42). Унчченхи докладсем сӗннӗ механизма ҫирӗплетнӗ (43, 44). Плазма мембрани ҫинчи олиголектинсен, патогенсен е антителасен керамид никӗсӗ ҫинче тунӑ гликосфинголипидсемпе (GSL) нумай валентлӑ ҫыхӑнӑвӗ пысӑк GSL агрегацине пуҫлать, фазӑсен уйрӑлӑвне вӑйлатать тата мембрана деформацине тата интернализацине кӑларса тӑратать (44). Ивабучи тата ытти те. (43) Вӑрӑм (С24), анчах кӗске мар (С16) ацил сӑнчӑрӗсем пур чухне GSL лактозилцерамидпа ҫыхӑннӑ нумай валентлӑ лиганд пысӑк кластерсем йӗркелеме тата мембранӑна инвагинацилеме пуҫланине, листоксем ҫинчи цитоплазма Lyn-медиациллӗ сигнал трансдукцийӗ вара нейтрофилсен сӑнчӑрӗсен мӑшӑрӗсем хушшинче пулнине тупса палӑртнӑ.
Сӗтпе ӳстерекен чӗрчунсен поляризациленӗ эпителий клеткисенче анти-Гольджи сечӗн (TGN) апикальнӑй плазма мембрани шайӗнчи концентрацийӗ GPI-AP уйӑрассине тата сортировкине тытса тӑрать (10, 45). Ку агрегацие GPI-AP олигомеризацийӗ (36) ертсе пырать, анчах вӑл эпир йӳҫекре тупнӑ керамид сӑнчӑрӗн тӑршшӗнчен те килет. Сӗтпе ӳстерекен чӗрчунсен GPI-AP-ӗ эфир липидӗ ҫинче никӗсленнӗ якорь пур пулин те, унӑн хими тытӑмӗ питӗ вӑрӑм ацил сӑнчӑрлӑ керамидран питӗ уйрӑлса тӑрать пулин те, нумаях пулмасть тунӑ тӗпчев икӗ липидӑн та эволюци тӗлӗшӗнчен пӗр пек физикӑпа хими характеристикисем тата функцийӗсем пуррине палӑртнӑ (40). Ҫавӑнпа та сӗтпе ӳстерекен чӗрчунсен клеткисенчи эфир липид пайӗ йӳҫекри С26 керамид евӗрлӗ пулма пултарать, унӑн ролӗ — мембранӑри вӑрӑм сӑнчӑрлӑ керамидпа ҫыхӑнса GPI-AP агрегацине тата сортировкине пулӑшасси. Ҫак майлӑха тӳрремӗнех тӗрӗслемелле-ха пулин те, унчченхи тупӑшусем вӑрӑм ацил сӑнчӑрлӑ керамид Гольджи ӳтне куҫарассине цитоплазма куҫармалли белоксем мар, йӳҫек пек GPI якорьсен синтезӗнчен килет тесе ҫирӗплетеҫҫӗ. Ҫавӑнпа та эволюциллӗ консервативлӑ механизм пӗр транспорт пузырькинче питӗ вӑрӑм ацил сӑнчӑрлӑ керамидпа GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) суйласа илсе пӗрле турттарма пултарать пек туйӑнать.
Йӳҫек тата сӗтпе ӳстерекен чӗрчунсен поляризациленӗ эпителий клеткисен тытӑмӗсенче GPI-AP агрегацийӗ тата ытти плазма мембранин белокӗсенчен уйрӑлни пурте клетка ҫийӗ ҫине ҫитичченех пулса пырать. Паладино тата ыттисем. (48) ҫакна тупса палӑртнӑ: сӗтпе ӳстерекен чӗрчунсен поляризациленӗ эпителий клеткисен TGN ҫинче GPI-AP кластеризацийӗ GPI-AP-сене апикальнӑй плазма мембрани ҫине суйласа илсе классификацилеме кӑна мар, GPI-AP-сен кластеризаци организацине тата унӑн биологи активлӑхне те йӗркелесе тӑрать. Клетка ҫийӗ. Ҫак тӗпчев ҫакна кӑтартнӑ: ER ҫинчи C26 керамидран килекен GPI-AP кластерӗ плазма мембрани ҫинчи GPI-AP кластер организацине тата функциллӗ ӗҫне йӗркелеме пултарать (24, 49). Ҫак модельпе килӗшӳллӗн, GhLag1 клеткисем GPI ингибиторӗсем ҫине е клетка стенисен тӗрӗслӗхне витӗм кӳрекен препаратсем ҫине аллергиллӗ (28), ҫавӑнпа та йӳҫек клеткисен мӑшӑрланӑвӗнче проекциленӗ вӗҫ керамидӑн функциллӗ Gas1-GFP кластерӗсем (49) кирли G hLag1 клеткисен пулма пултаракан физиологиллӗ ҫивӗчлӗхӗсене кӑтартать. GPI-AP йӑнӑшӗ. Анчах та клетка ҫийӗн функциллӗ организацине липид тӑршшӗ тӑрӑх сортировка мелӗпе ЭР-ран программӑланине малалла тӗрӗслесси пирӗн малашнехи тӗпчевӗн теми пулӗ.
Ҫак ӗҫре усӑ курнӑ Saccharomyces cerevisiae штаммӗсене S1 таблицӑра кӑтартнӑ. Чӗрӗ клеткӑсене ӳкерме SCLIM-ӑн MMY1583 тата MMY1635 штаммӗсене W303 фонӗнче тунӑ. Sec13-mCherry флуоресцентлӑ белок тегӗпе экспрессилекен ҫак штаммсене полимеразӑллӑ ҫыхӑнуллӑ реакци (ПЦР) никӗсӗ ҫинче pFA6a плазмидӑна шаблон вырӑнне илсе тунӑ (23). GAL1 промоторӗн контролӗ айӗнче флуоресцентлӑ белокпа паллӑ тунӑ Mid2-iRFP экспрессилекен штамма ҫапла тунӑ. pKTiRFP-KAN векторӗнчен iRFP-KanMx йӗркине ПЦР амплификацилесси (E. O'Shea парни, Addgene плазмидӑн номерӗ 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; тӗпчев ресурсӗн идентификаторӗ (RRID): Addgene_64687) тата C2-мӗш вӑтам вӗҫне кӗртнӗ. Mid2-iRFP геном йӗркине амплификациленӗ тата GAL1 промоторне клонланӑ хыҫҫӑн ӑна pRS306 интеграци плазмидин Not I-Sac I сайтне интеграциленӗ. Ҫакӑн хыҫҫӑн пулса тухнӑ pRGS7 плазмидӑна Pst I-па URA3 локусне интеграцилеме линейнӑй тунӑ.
Gas1-GFP синтез генӗ центромер (CEN) плазмидинче GAL1 промоторӗн контролӗ айӗнче экспрессиленет, ӑна ҫапла тунӑ. Gas1-GFP йӗркине pRS416-GAS1-GFP плазмидӑран (24) (L. Popolo парни) ПЦР мелӗпе амплификациленӗ те CEN плазмидӑн pBEVY-GL LEU2 (C парни) Xma I–Xho I сайтне клонланӑ. Миллер; Адген плазмидӑн номерӗ 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Ҫапла пулса тухнӑ плазмидӑна pRGS6 ят панӑ. Axl2-GFP синтез генӗ pBEVY-GL LEU2 векторӗн GAL1 промоторӗн контролӗ айӗнче те экспрессиленет, унӑн конструкцийӗ ҫакӑн пек. Axl2-GFP йӗркине pRS304-p2HSE-Axl2-GFP плазмидӑран (23) ПЦР мелӗпе амплификациленӗ те pBEVY-GL LEU2 векторӗн Bam HI-Pst I сайтне клонланӑ. Ҫапла пулса тухнӑ плазмидӑна pRGS12 ят панӑ. Ҫак тӗпчевре усӑ курнӑ олигонуклеотидсен йӗркине S2 таблицӑра кӑтартнӑ.
Штамма 0,2% аденин тата 2% глюкоза [YP-декстроза (YPD)], 2% рафинозӑпа [YP-рафиноза] пуян йӳҫек экстракчӗн белок p (YP) хутӑшӗпе (1 % йӳҫек экстракчӗ тата 2% белок ept) хушнӑ. (YPR)] е 2% галактоза [YP-галактоза (YPG)] углерод ҫӑлкуҫӗ пек, е синтетика минимум хутлӑхӗнче (0,15% йӳҫӗ азот никӗсӗ тата 0,5% аммиак сульфачӗ) апатланма кирлӗ тивӗҫлӗ аминокислотӑсемпе никӗссене хушма, тата 2% глюкоза (2% глюкоза хутӑшӗ) е минимум глюкоза хутӑшӗнче галактоза (синтетика галактоза минимум хутлӑхӗ) углерод ҫӑлкуҫӗ пек.
Чӑн-чӑн вӑхӑтри ӳкерчӗксем валли GAL1 промоторӗ айӗнче конструкцие экспрессилекен температурӑна сисӗмлӗ sec31-1 мутант клеткисене YPR хутлӑхӗнче 24°C температурӑра ҫӗр каҫиччен ҫурма лог фазине ҫитиччен ӳстернӗ. YPG-ра 24°C температурӑра 1 сехет хушши индукциленӗ хыҫҫӑн клеткӑсене 37°C температурӑра 30 минут хушши SG-ра инкубациленӗ, унтан секреци блокӗнчен кӑларма 24°C ҫине куҫарнӑ. Конканавалин А-па усӑ курса клеткӑсене кӗленче ҫине ҫирӗплетнӗ, ӑна SCLIM мелӗпе ӳкернӗ. SCLIM — Olympus IX-71 инвертлӑ флуоресценци микроскопӗпе UPlanSApo 100×1.4 цифрӑллӑ диафрагмӑллӑ ҫу линзи (Olympus), пысӑк хӑвӑртлӑхлӑ тата пысӑк сигнал-шав шайлашӑвӗллӗ ҫаврӑнакан дисклӑ конфокаллӑ сканер (Yokogawa Electric), ятарлӑ спектрометр, интенсивлӑ ӳкерчӗк системин комбинацийӗ (Hamamatsu Photonics) ×266,7 юлашки пысӑклатмалли лупа системине тата электронсене хутлакан зарядлӑ хатӗр камери (Hamamatsu Photonics) (21) пама пултарать. Сӑнӳкерчӗксене ятарлӑ программӑпа (Yokogawa Electric) илеҫҫӗ. 3D ӳкерчӗксем валли эпир объектив линзине вертикаллӗ вибрацилеме ятарласа тунӑ пьезоэлектрикӑллӑ приводпа усӑ куртӑмӑр, оптика пайӗсене 100 нм хушшинче пӗр стека пуҫтартӑмӑр. Z-стек ӳкерчӗкне 3D воксель даннӑйӗсене куҫараҫҫӗ, ҫаврӑнакан дисклӑ конфокаллӑ микроскоп валли усӑ куракан теориллӗ точка сарӑлӑвӗн функцийӗпе вара Volocity программипе (PerkinElmer) деконволюци ӗҫне тума усӑ кураҫҫӗ. Volocity программипе усӑ курса, пӗрле вырнаҫтармалли анализ валли автоматла чикӗ лартса, ERES виҫнӗ, ҫав шутра груз та. Лини сканерӗн анализне MetaMorph программӑпа (Molecular Devices) усӑ курса тунӑ.
Статистика пӗлтерӗшне палӑртма GraphPad Prism программӑпа усӑ курӑр. Икӗ енлӗ Студент t-тестӗ тата ахаль пӗр енлӗ дисперси анализӗн (ANOVA) тестӗшӗн ушкӑнсем хушшинчи уйрӑмлӑхсем P <0,05 (*) ҫине пысӑк витӗм кӳнине шутлаҫҫӗ.
Gas1-GFP флуоресценци микроскопийӗ валли лог-фазӑллӑ клеткӑсене YPD-ра ҫӗр каҫа ӳстернӗ те центрифугӑпа пуҫтарнӑ, фосфатпа буферланӑ тӑварлӑ шывпа икӗ хутчен ҫуса тасатнӑ, пӑр ҫинче сахалтан та 15 минут инкубациленӗ, унтан малтан ҫырса кӑтартнӑ пек микроскоп айӗнче ӗҫленӗ (24). Ҫак ӗҫе пурнӑҫлама Leica DMi8 микроскоппа (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) усӑ курнӑ, ӑна объективлӑ линзӑпа, L5 (GFP) фильтрпа, Hamamatsu камерӑпа тата Application Suite X (LAS X) программӑпа тивӗҫтернӗ. .
Пробӑсене 65°C температурӑра 10 минут хушши SDS проба буферӗпе денатурациленӗ, унтан SDS-полиакриламид гель электрофорезӗпе (PAGE) уйӑрнӑ. Иммуноблот анализӗ валли кашни йӗр ҫине 10 мкл проба янӑ. Пӗрремӗш антитела: кролик поликлоналлӑ анти-Gas1 1:3000 ирӗлчӗкпе, кролик поликлоналлӑ анти-Emp24 1:500 ирӗлчӗкпе тата кролик поликлоналлӑ анти-GFP (H. Riezman парни) 1:3000 ирӗлчӗкпе усӑ курмалла. Шӑши моноклоналлӑ анти-Pgk1 антителине 1:5000 шайра ирӗлтерсе усӑ курнӑ (J. de la Cruz парни). Иккӗмӗш антитела: Хрен пероксидази (HRP) конъюгациленӗ качака анти-кролик иммуноглобулин G (IgG) 1:3000 (Пирс) ирӗлчӗкпе усӑ курнӑ. HRP-конъюгациленӗ качака анти-шӑши IgG 1:3000 (Пирс) ирӗлчӗкпе усӑ курнӑ. Иммунлӑ хурав зонине SuperSignal West Pico реагенчӗн (Thermo Fisher Scientific) химилюминесценци мелӗпе сӑнанӑ.
(31)-мӗшӗнче ҫырса кӑтартнӑ пек, пуянлатнӑ ER фракцийӗ ҫинче ҫутҫанталӑк иммунопреципитаци экспериментне туса пӑхнӑ. Кӗскен каласан, йӳҫек клеткисене TNE буферпа [50 мМ tris-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид тата протеаза ингибиторӗн хутӑшӗ) 600 нм (OD600) 100 оптика ҫӑраҫҫипе икӗ хутчен ҫумалла. Ӑна кӗленче шӑрҫасемпе ҫӗмӗрнӗ, унтан клетка ҫӳп-ҫапне тата кӗленче шӑрҫисене центрифугӑпа кӑларнӑ. Унтан ҫиелти шыва 17 пин г 15 минут хушши 4°С температурӑра центрифугӑланӑ. Пеллета TNE-ра ҫӗнӗрен суспендированнӑ та 1% юлашки концентрацие ҫитиччен дигиталис сапонин хушнӑ. Суспензие 1 сехет хушши 4°C температурӑра ҫавӑрса инкубациленӗ, унтан ирӗлмен компонентсене 13 пин г 4°C температурӑра 60 минут центрифугӑласа кӑларнӑ. Gas1-GFP иммунопреципитацийӗ валли малтан пробӑна пушӑ агароза шӑрҫисемпе (ChromoTek) 4°C температурӑра 1 сехет хушши малтанах инкубацилемелле, унтан GFP-Trap_A (ChromoTek) 4°C температурӑра 3 сехет хушши инкубацилемелле. Иммунопреципитациленӗ шӑрҫасене 0,2% дигоксигенинлӑ TNE-па пилӗк хутчен ҫуса тасатнӑ, SDS проба буферӗпе элюирланӑ, SDS-PAGE ҫинче уйӑрнӑ та иммуноблоттинг мелӗпе анализланӑ.
(31)-мӗшӗнче ҫырса кӑтартнӑ пек, пуянлатнӑ ER фракцийӗ ҫинче ҫыхӑну палӑртассине туса пынӑ. Кӗскен каласан, пуянлатнӑ ER фракцине 0,5 мМ дитиобиспа (сукцинимидил пропионатпа) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 мин) инкубациленӗ. Ҫыхӑну реакцине глицин (50 мМ юлашки концентраци, 5 минут, 20°C) хушса сӳнтернӗ.
Маларах ҫырса кӑтартнӑ пек (50), тискер йышши тата GhLag1 штаммсенчи керамидӑн МС анализне тунӑ. Кӗскен каласан, клеткӑсене 30°C температурӑра YPD-ра экспоненциаллӑ тапхӑра (3-4 OD600 единица/мл) ӳстернӗ, 25×107 клетка пухнӑ. Вӗсен ылмашӑнӑвне трихлоруксус кислотипе сӳнтереҫҫӗ. Экстракци ирӗлтерекен япалапа [этанол, шыв, эфир, пиридин тата 4,2 н аммиак гидроксичӗ (15:15:5:1:0,018 v/v)] тата 1,2 нмоль шалти стандартлӑ C17 керамид (860517, Avanti полярлӑ липид) пахалӑхӗпе усӑ курӑр. Экстракта ҫемҫе шӗвек гидролизне тума монометиламин реактивӗпе [метанол, шыв, н-бутанол тата метиламин ирӗлчӗкӗ (4:3:1:5 v/v)] усӑ курмалла, унтан шывпа тултарнӑ н-бутанолпа тӑварсӑрлатмалла. Юлашкинчен экстракта лайӑх режимлӑ ирӗлтерекенре [хлороформ/метанол/шыв (2:7:1) + 5 мМ аммиак ацетат] ҫӗнӗрен суспендированнӑ та масс-спектрометра янӑ. Сфинголипид молекулисене тупса палӑртма тата вӗсен шутне палӑртма нумай реакциллӗ мониторинг (МРМ) туса пынӑ. TSQ Vantage виҫҫӗмӗш квадрупольлӑ масс-спектрометр (Thermo Fisher Scientific) липид анализӗ валли Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) роботлӑ наноюхӑм ион ҫӑлкуҫӗпе тивӗҫтернӗ. Ҫапӑну энергине кашни керамид категорийӗ валли оптимизациленӗ. МС даннӑйӗсене лайӑх режимра илнӗ. Кашни биологиллӗ репликӑшӑн липид сигналӗ виҫӗ никама пӑхӑнман виҫевӗн медиани пулать.
(31)-мӗшӗнче ҫырса кӑтартнӑ пек, Gas1-GFP экспрессилекен клеткӑсене (800×107) ҫутҫанталӑк иммунопреципитацине кӗртнӗ. Тасатнӑ Gas1-GFP SDS-PAGE мелӗпе уйӑрнӑ та поливинилиденфторид (PVDF) мембрани ҫине куҫарнӑ. Белок PVDF-а амид хура тӗсӗпе сӑрласа визуализациленӗ. Gas1-GFP йӗрне PVDF-ран касса илнӗ те 5 хутчен метанолпа тата пӗр хутчен шӗвек хроматографи-MS (LC-MS) сортлӑ шывпа ҫуса тасатнӑ. Мембрана лентине 500 мкл 0,3 М NaOAc (рН 4,0), буферпа тата 500 мкл тин ҫеҫ ирӗлнӗ 1 М натрий нитричӗн хутӑшӗпе 37°C температурӑра 3 сехет хушши инкубацилесен, липид фракцийӗ Gas1-GFP-ран тухать те лизированнӑй Фотефозамин фотеаминофазина 37°C температурӑра 3 сехет хушши кӑларать (51). Ун хыҫҫӑн мембрана лентине LC-MS сортлӑ шывпа тӑватӑ хутчен ҫуса тасатнӑ, пӳлӗм температуринче типӗтнӗ те анализ тӑвиччен -80°C азот атмосферинче упранӑ. Контроль вырӑнне кашни эксперимент валли ПВДФ мембранӑн пушӑ тӗслӗхне илнӗ. Gas1-GFP-ран илнӗ липида вара MS мелӗпе ҫырса кӑтартнӑ пек анализланӑ (50). Кӗскен каласан, GPI-липидлӑ ПВДФ полоскисене 75 мкл отрицательнӑй кӑмпа ирӗлтерекенӗнче [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ аммиак ацетат] ҫӗнӗрен суспендированнӑ та электроспрей ионизацийӗ (ESI)-MRM/MS сфинголипид тӗсӗсен анализӗ (TSQ Vantage) витӗр кӑларнӑ. Ку тӗслӗхре МС даннӑйӗсене отрицательнӑй ион режимӗнче илнӗ.
Маларах асӑннӑ пекех, GPI якорьӗн липид пайне [3H]-инозитолпа паллӑ тунӑ GPI-AP-ран уйӑрнӑ (16). Липидсене ирӗлтерекен системӑпа (55:45:10 хлороформ-метанол-0,25% KCl) усӑ курса ҫӳхе сийлӗ хроматографипе уйӑрнӑ та FLA-7000 (Fujifilm) меслечӗпе визуализациленӗ.
Gas1-GFP (600×107) экспрессилекен клеткӑсене TNE буферӗпе TNE буферӗпе икӗ хутчен ҫуса тасатнӑ, унтан кӗленче шӑрҫасемпе ҫӗмӗрнӗ, унтан клетка ҫӳп-ҫапӗпе кантӑк шӑрҫисене кӑларса пӑрахма центрифугӑланӑ. Унтан ҫиелти шыва 17 пин г ҫинче 1 сехет хушши 4°С температурӑра центрифугӑланӑ. Пеллета TNE-ра ҫуса тасатнӑ та 1 U PI-PLC (Invitrogen) TNE-ра 0,2% digitalis saponin хушса 37°C температурӑра 1 сехет хушши инкубациленӗ. Ферментпа ӗҫленӗ хыҫҫӑн мембранӑна 17 пин г 4°C температурӑра 1 сехет хушши центрифугӑласа кӑларнӑ. Gas1-GFP иммунопреципитацилеме супернатант GFP-Trap_A (ChromoTek) 4°C температурӑра ҫӗр каҫа инкубациленӗ. SDS-PAGE мелӗпе уйӑрнӑ тасатнӑ Gas1-GFP-а Кумасси ҫутӑ кӑвакӗпе сӑрланӑ. Gas1-GFP тӗслӗ йӗре акведук таврашӗнчи сӑрӑ тӗсрен касса илнӗ, унтан йодацетамидпа алкилланӑ тата дитиотреитолпа редукциленӗ хыҫҫӑн трипсинпа гель ӑшӗнче ирӗлтернӗ. Триптикӑллӑ пептидсемпе пептидсене GPI-гликансемпе кӑларса типӗтмелле. Типӗтнӗ пептида 20 мкл шывра ирӗлтернӗ. ЖК-на пӗр пай (8 мкл) ямалла. Ятарлӑ градиент условийӗсенче пептидсене уйӑрма октадецилсилан (ODS) колонкипе (Develosil 300ODS-HG-5; шалти диаметрӗ 150 мм×1,0 мм; Nomura Chemical, Айти префектура, Япони) усӑ курнӑ. Куҫса ҫӳрекен фаза — А ирӗлтерекен (0,08% кӑткӑс кислоти) тата В ирӗлтерекен (0,15% кӑткӑс кислоти 80% ацетонитрилра). Accela HPLC системипе (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) колонкӑна А ирӗлтерекенпе 55 минут хушшинче 50 мкл мин-1 юхӑм хӑвӑртлӑхӗпе 5 минут хушши элюциленӗ, унтан В ирӗлтерекенӗн концентрацине 40% таран ӳстернӗ. , Пӗрлешӳллӗ Штатсем). Элюата ESI ион ҫӑлкуҫне пӗр чарӑнмасӑр кӗртнӗ, триптикӑллӑ пептидсемпе GPI-гликанлӑ пептидсене LTQ Orbitrap XL (гибридлӑ линейнӑй ионлӑ капкӑн-орбитрап масс-спектрометрӗ; Thermo Fisher Scientific) мелӗпе анализланӑ. МС настройкинче капилляр ҫӑлкуҫӗн напряженине 4,5 кВ лартнӑ, куҫӑм капиллярӗн температурине 300°C тытса тӑнӑ. Капилляр напряженийӗпе трубка линзин напряженийӗ 15 В тата 50 В пулнӑ. МС даннӑйӗсене 300/м/з масса/заряд шайлашӑвӗ (м/з) 3000 массӑллӑ диапазонра лайӑх ион режимӗнче (60 пин уйӑрӑмлӑх; 10 пай миллионра масса тӗрӗслӗхӗ) илнӗ. ҫапӑннипе пулакан диссоциаци (CID)].
МД моделированийӗсене GROMACS (52) программӑпа тата MARTINI 2 вӑй уйӗпе (53-55) усӑ курса тунӑ. CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) вара диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) тата Cer C18 е DOPC тата Cer C26 хушса икӗ сий тума усӑ курнӑ. Cer C26 топологийӗпе координачӗсене DXCE-ран сфингозин хӳринчен ытлашши шӑрҫасене кӑларса илнӗ. Икӗ сийне шайлаштарма тата ӑна ӗҫлеттерме ҫакӑнта ҫырса кӑтартнӑ процеспа усӑ курӑр, унтан системӑн юлашки координачӗсемпе усӑ курса Emp24 пур системӑна тӑвӑр. Emp24 йӳҫекӗн трансмембранӑллӑ доменне (173-193 юлашкисем) α-спираль пек курӑнакан MD (VMD) инструментӑн молекулярлӑ структурипе усӑ курса тунӑ (58). Унтан, пӗр-пӗрин ҫине ӳкнӗ липидсене кӑларса пӑрахнӑ хыҫҫӑн, белока хытӑ гранулӑланӑ та CHARMM GUI меслечӗпе усӑ курса икӗ сий ӑшне кӗртнӗ. Юлашки системӑра 1202 DOPC тата 302 Cer C26 е 1197 DOPC тата 295 Cer C18 тата Emp24 пур. Системӑна 0,150 М концентраци таран ионизацилемелле. Икӗ сийлӗ композици валли тӑватӑ никама пӑхӑнман репликаци тунӑ.
Липидсен икӗ сийне CHARMM GUI процесӗпе усӑ курса шайлаштараҫҫӗ, унта 405 пин утӑма чакармалла, унтан шайлаштармалла, унта позици чиккисене майӗпен чакарса пӗтереҫҫӗ, вӑхӑт утӑмне 0,005 пс-ран 0,02 пс таран ӳстереҫҫӗ. Эквивалент хыҫҫӑн вӑл 0,02 пс вӑхӑт утӑмӗпе 6 мкс туса кӑларать. Emp24 лартнӑ хыҫҫӑн ҫав CHARMM GUI процесӗпех усӑ курса системӑна пӗчӗклетмелле тата шайлаштармалла, унтан 8 ҫеккунт хушши производствӑра ӗҫлемелле.
Пур системӑсемшӗн те шайлашу процесӗ вӑхӑтӗнче пусӑма Берендсен баростачӗ (59) тытса тӑрать, производство процесӗ вӑхӑтӗнче вара пусӑма Парринелло-Рахман баростачӗ (60) тытса тӑрать. Пур тӗслӗхре те вӑтам пусӑм 1 бар, ҫурма изотроплӑ пусӑм ҫыхӑнӑвӗн схемипе усӑ кураҫҫӗ. Баланс тата производство процесӗнче хӑвӑртлӑха ҫӗнӗрен калибровка тӑвакан ​​термостатпа (61) белок, липид тата ирӗлтерекен пайӑркасен температурине ҫыхӑнтарма усӑ кураҫҫӗ. Пӗтӗм ӗҫ вӑхӑтӗнче тӗллевлӗ температура 310К пулмалла. Ҫыхӑнман хутшӑнӑва 0,005 буфер тӳсӗмлӗхӗпе Верле схемипе усӑ курса мӑшӑрлану списокне туса шутлаҫҫӗ. Кулон членне реакци уйӗпе тата 1,1 нм чикӗ хушшипе усӑ курса шутлаҫҫӗ. Вандер Ваалс терминӗ 1,1 нм чикӗллӗ чикӗ схемипе усӑ курать, Верле чикӗ схемипе вара потенциаллӑ дрейф валли усӑ кураҫҫӗ (62).
VMD меслечӗпе усӑ курса DOPC фосфат шӑрҫисемпе е керамид AM1 шӑрҫисемпе белок хушшинчи чикӗ хумӗн тӑршшӗ 0,7 нм, белокпа хутшӑнакан липидсен шутне шутласа кӑлараҫҫӗ. Ҫак формулӑпа килӗшӳллӗн (63)-ри пек ҫухату-пуянлану (DE) коэффициентне шутласа кӑларӑр: DE коэффициенчӗ = (белокри пӗтӗмӗшле липидсен виҫи 0,7) белокри 0,7 (пӗтӗмӗшле липидсенчи Cer виҫи)
Пӗлтернӗ хака вӑтамран илеҫҫӗ, йӑнӑш йӗрӗсем вара SE-н тӑватӑ никама пӑхӑнман копийӗ пулса тӑраҫҫӗ. DE факторӑн статистика пӗлтерӗшне t-тестпа [(averageDE-factor-1)/SE] шутласа кӑлараҫҫӗ. Пӗр енлӗ валеҫӳрен Р хакне шутласа кӑларӑр.
GROMACS инструментпа усӑ курса йӗрӗн юлашки 250 нс хушшинче Emp24 пур тытӑмӑн 2D айккинчи ҫӑра карттине шутласа кӑларнӑ. Керамидӑн пуянлану/пӗтӗмӗшле карттине илес тесен, Cer ҫӑра карттине Cer тата DOPC карттисен суммине пайлаҫҫӗ, унтан организмри Cer концентрацийӗ ҫине пайлаҫҫӗ. Ҫавӑн пекех тӗслӗ карттӑ шкалипе усӑ кураҫҫӗ.
Ҫак статья валли хушма материалсем илме http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Ку вӑл — уҫӑ доступлӑ статья, ӑна Creative Commons Attribution-Non-Commercial License условийӗсемпе салатаҫҫӗ, вӑл кирек мӗнле хатӗрпе те усӑ курма, салатма тата ҫӗнӗрен кӑларма май парать, анчах та юлашки хут коммерциллӗ усӑ валли мар тата малтанхи ӗҫ тӗрӗс пулни ҫинчен калакан никӗс пулсан. Ссылка.
Асӑрхаттару: Эпир сире хӑвӑрӑн электронлӑ почта адресне ҫеҫ ыйтатпӑр, ҫапла вара эсир страницӑна сӗнекен ҫын эсир электронлӑ почтӑна курасшӑн пулнине тата вӑл спам маррине пӗлтӗр. Эпир нимӗнле электронлӑ почта адресӗсене те ҫырса илместпӗр.
Ку ыйтупа эсир хӑна пулнине тӗрӗслеме тата спам автоматла ярса пама чарма усӑ кураҫҫӗ.
София Родригес-Галлардо, Кадзуо Курокава, Сюзанна Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес -Линерхио Лопе (Серхопе), Лопес Лопе (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D пысӑк ҫивӗчлӗхлӗ чӑн-чӑн вӑхӑтри ӳкерчӗксем суйласа илнӗ тухӑҫ вырӑнӗсенче белоксене сортлама керамид сӑнчӑрӗн тӑршшӗн пӗлтерӗшне уҫса параҫҫӗ.
София Родригес-Галлардо, Кадзуо Курокава, Сюзанна Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксиадора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес -Линерхио Лопе (Серхопе), Лопес Лопе (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D пысӑк ҫивӗчлӗхлӗ чӑн-чӑн вӑхӑтри ӳкерчӗксем суйласа илнӗ тухӑҫ вырӑнӗсенче белоксене сортлама керамид сӑнчӑрӗн тӑршшӗн пӗлтерӗшне уҫса параҫҫӗ.
©2020 Америка наукӑна аталантарас енӗпе ӗҫлекен ассоциацийӗ. пур правӑсем те сыхланса юлнӑ. AAAS — HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef тата COUNTER компанисен партнерӗ. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.