Хальхи вӑхӑтра *Хальхи адрес: Кельн 50931, Германи, Кельн ватӑлнипе ҫыхӑннӑ чирсенче клеткӑсен стрессне хирӗҫ кӗрешесси ҫинчен тӗпчес енӗпе ӗҫлекен чаплӑ кластер (CECAD).
Митохондри чирӗсен нейродегенерацине каялла тавӑрма ҫук тесе шутлаҫҫӗ, мӗншӗн тесен нейронсен ылмашӑну пластичлӑхӗ чакнӑ, анчах та митохондри дисфункцийӗ организмри нейронсен ылмашӑнӑвӗн клетка автономийӗ ҫине мӗнле витӗм кӳнине начар ӑнланаҫҫӗ. Кунта эпир митохондрисен пӗрлешӗвӗн динамики пӑсӑлнипе пулакан прогрессивлӑ OXPHOS ҫитменлӗхӗпе Пуркинже нейронӗсен клетка-спецификлӑ протеомне кӗртетпӗр. Эпир митохондри дисфункцийӗ протеомика енӗпе тарӑн улшӑну кӑларса тӑратнине тупрӑмӑр, юлашкинчен вара клетка виличчен тӗп ылмашӑну программисене йӗркеллӗн активизацилеме май пачӗ. Кӗтмен ҫӗртен эпир пируват карбоксилазӑн (PCx) тата ытти пероксидазӑсен ТСА циклӗн вӑтам продукчӗсене хушса панипе ҫыхӑннӑ паллӑ индукцие палӑртрӑмӑр. PCx-а чарни оксидациллӗ стресса тата нейродегенерацие вӑйлатнӑ, ҫакӑ атеросклероз OXPHOS ҫук нейронсенче хӳтӗлев витӗмӗ кӳнине кӑтартать. Вӗҫӗнче ҫӗрсе кайнӑ нейронсенче митохондрисен пӗрлешӗвне тавӑрасси ҫак ылмашӑну характеристикисене пӗтӗмпех каялла тавӑрать, ҫавна май клетка вилӗмӗнчен сыхлать. Пирӗн тупӑшусем унччен паллӑ мар ҫулсене палӑртаҫҫӗ, вӗсем митохондри дисфункцине хирӗҫ тӑма пулӑшаҫҫӗ тата нейродегенерацие чирӗн юлашки тапхӑрӗнче те каялла тавӑрма май пуррине кӑтартаҫҫӗ.
Нейронсен энерги ылмашӑвне тытса тӑрас ӗҫре митохондрисен тӗп вырӑнне этем митохондри чирӗсемпе ҫыхӑннӑ анлӑ неврологи паллисем палӑртаҫҫӗ. Ҫак чирсенчен ытларахӑшӗ митохондри генӗсен экспрессине йӗркелекен генсен мутацийӗсенчен (1, 2) е митохондрисен динамикипе ҫыхӑннӑ генсене пӗтернипе пулаҫҫӗ, вӗсем митохондрисен ДНК (мтДНК) стабиллӗхне тӳрремӗнех витӗм кӳреҫҫӗ (3, 4). Чӗрчунсен моделӗсем ҫинче ӗҫлени ҫакна кӑтартса панӑ: таврари тканьсенчи митохондри дисфункцийӗ ҫине хуравланӑ май консервативлӑ ылмашӑну ҫулӗсем (5-7) активизациленме пултараҫҫӗ, ҫапла вара ҫак кӑткӑс чирсен патогенезӗ ҫинчен пӗлтерӗшлӗ ӑнланусем параҫҫӗ. Унпа танлаштарсан, пуҫ миминчи митохондри аденозинтрифосфат (АТФ) туса кӑларасси пӗтӗмӗшле ҫитменнипе пулакан уйрӑм клетка тӗсӗсен ылмашӑну улшӑнӑвӗсене ӑнланни тӗп вырӑнта тӑрать (8), ҫакӑ чире асӑрхаттарма е асӑрхаттарма усӑ курма пултаракан сиплев тӗллевӗсене палӑртмаллине палӑртать. Нейродегенерацие асӑрхаттармалла (9). Информаци ҫитменни вӑл — нерв клеткисем таврари тканьсен клеткисен тӗсӗсемпе танлаштарсан питӗ пӗчӗк ылмашӑну ҫаврӑнӑҫулӑхӗ пур тесе шутлаҫҫӗ (10). Ҫак клеткӑсем нейронсене метаболитсемпе тивӗҫтерессине йӗркелесе тӑрас ӗҫре тӗп вырӑн йышӑннине шута илсен, синаптикӑллӑ куҫӑмсене аталантарма тата суранланнипе чир-чӗр условийӗсене хирӗҫ кӗрешме клеткӑсен метаболизмне пуҫ мимин йывӑр условийӗсене хӑнӑхтарма пултарни глиаллӑ клеткӑсемпе ҫеҫ чикӗленет (11-14). Унсӑр пуҫне, пуҫ мимин тканӗн хӑйне евӗрлӗ клеткӑллӑ гетерогенлӑхӗ уйрӑм нейронсен ушкӑнӗсенче пулакан ылмашӑну улшӑнӑвӗсене тӗпчеме чылай чӑрмантарать. Ҫавна май нейронсенчи митохондри дисфункцийӗн тӗп клетка тата ылмашӑну ҫивӗчлӗхӗсем ҫинчен сахал пӗлеҫҫӗ.
Митохондри дисфункцийӗн ылмашӑну ҫивӗчлӗхне ӑнланас тесе эпир митохондри тулаш мембранин пӗрлешӗвне (Mfn2) пӗтернипе пулакан нейродегенерацин тӗрлӗ тапхӑрӗнчи Пуркинже нейронӗсене (ПН) уйӑртӑмӑр. Ҫынсен Mfn2 мутацийӗсем Шарко-Мари-Тут 2А типӗ текен еткерлӗхлӗ моторлӑ сенсорлӑ нейропати формипе ҫыхӑннӑ пулин те (15), шӑшисенче Mfn2-на условнӑй майпа пӗтерни — оксидаци фосфорилировани (OXPHOS) дисфункцийӗн меслечӗн лайӑх йышӑннӑ индукцийӗ. Тӗрлӗ нейрон подтипӗсем (16-19) тата вӗсенчен пулакан нейродегенеративлӑ фенотип прогрессивлӑ неврологи паллисемпе пӗрле пулаҫҫӗ, сӑмахран, хускану пӑсӑлни (18, 19) е пуҫ мимин атаксийӗ (16). Ярлыксӑр йышлӑ (LFQ) протеомика, метаболомика, ӳкерчӗк тата вирусологи меслечӗсен комбинацийӗпе усӑ курса эпир прогрессивлӑ нейродегенераци пируват карбоксилазӑна (PCx) тата in vivo ПН-сен артериосклерозне хутшӑнакан ытти факторсене вӑйлӑн аталантарнине кӑтартатпӑр. Ферментсен экспрессийӗ. Ҫак тупӑшӑн пӗлтерӗшне тӗрӗслес тесе эпир Mfn2-дефицитлӑ ПН-сенче PCx экспрессине ятарласа чакартӑмӑр, ҫак операци оксидациллӗ стресса вӑйлатнине тата нейродегенерацие хӑвӑртлатнине тупрӑмӑр, ҫапла вара азоосперми клеткӑсен вилӗмне тивӗҫтернине ҫирӗплетрӗмӗр. MFN2-н хытӑ экспрессийӗ OXPHOS-ӑн йывӑр дегенерацийӗпе, митохондрисен ДНК-не нумай ҫинипе тата митохондрисен сечӗ татӑлнипе ҫыхӑннӑ терминаллӑ дегенерациллӗ PN-а пӗтӗмпех ҫӑлса хӑварма пултарать, ҫакӑ вара нейродегенерацин ҫак форми клеткӑсем виличчен чирӗн малалла кайнӑ тапхӑрӗнче те сывалма пултарнине татах та палӑртать.
Mfn2 нокаут PN-сенчи митохондрисене курма эпир Cre-зависимӑй митохондрисене сарӑ флуоресцентлӑ белок (YFP) (mtYFP) (20) Cre экспрессине тӗллев лартма май паракан шӑши штаммӗпе усӑ куртӑмӑр тата in vivo митохондри морфологине тӗрӗслерӗмӗр. Эпир PN-сенче Mfn2 гена пӗтерни митохондри сечӗ майӗпен пайланнине тупрӑмӑр (S1A ӳкерчӗк), чи малтанхи улшӑну вара 3 эрнере пулнӑ. Ун вырӑнне, PN клетка сийӗн пысӑк дегенерацийӗ, ӑна Calbindin иммуноокрашиванийӗ ҫухални кӑтартса парать, 12 эрне ҫитсен тин пуҫланнӑ (1-мӗш ӳкерчӗк, А тата В). Митохондри морфологийӗнчи чи малтанхи улшӑнусемпе нейронсен вилӗмӗн курӑнакан пуҫламӑшӗ хушшинчи вӑхӑт ҫитменлӗхӗ пире клетка вилӗмӗ умӗнхи митохондри дисфункцийӗпе пулакан ылмашӑну улшӑнӑвӗсене тӗпчеме хистенӗ. Эпир YFP (YFP+) экспрессилекен PN (1С ӳкерчӗк) тата контроль шӑшисенче (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) уйӑрса илме флуоресценципе активизациленӗ клетка сортировки (FACS) никӗсӗ ҫинче стратеги туса хатӗрлерӗмӗр, ӑна малалла CTRL тесе ят панӑ (S1B ӳкерчӗк). YFP сигналӗн шайлашуллӑ хӑватлӑхӗ ҫинче никӗсленнӗ шлюз стратегине оптимизацилени пире PN-сен YFP+ ӳтне (YFPhigh) PN маррисенчен (YFPneg) (S1B ӳкерчӗк) е путативлӑ флуоресцентлӑ аксон/дендрит фрагменчӗсенчен (YFPlow; S1D ӳкерчӗк, сулахайра) тасатма май парать, ҫакна конфокаллӑ микроскоппа ҫирӗплетнӗ (S1D ӳкерчӗк, сылтӑм). Классификациленӗ популяци кам пулнине тӗрӗслес тӗллевпе эпир LFQ протеомикине тата унтан тӗп компонентсен анализне туса пӑхрӑмӑр та YFPhigh тата YFPneg клеткисем хушшинче уҫҫӑн уйрӑмлӑх пуррине тупрӑмӑр (S1C ӳкерчӗк). YFPhigh клеткисем паллӑ PNs маркерӗсен (т. е. Calb1, Pcp2, Grid2 тата Itpr3) таса пуянлӑхне кӑтартнӑ (21, 22), анчах нейронсенче е ытти клетка типӗсенче анлӑ экспрессиленекен белоксен пуянланӑвӗ пулман (1D ӳкерчӗк) ). Хӑй тӗллӗн экспериментсенче пухнӑ классификациленӗ YFPhigh клеткӑсенчи пробӑсене танлаштарни корреляци коэффициенчӗ> 0,9 пулнине кӑтартнӑ, ҫакӑ биологи репликисем хушшинче лайӑх репродуктивлӑха кӑтартнӑ (S1E ӳкерчӗк). Пӗтӗмлетсе каласан, ҫак кӑтартусем пирӗн пурнӑҫа кӗртме пултаракан ПН-а ҫивӗч те уйрӑм изоляци тумалли плана ҫирӗплетрӗҫ. L7-cre драйвер системипе усӑ курни ҫуралнӑ хыҫҫӑнхи пӗрремӗш эрнере мозаика рекомбинацине пуҫарса янӑран (23), эпир шӑшисене CTRL тата условнӑй (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) нейронсене пухма пуҫларӑмӑр. Рекомбинаци вӗҫленсен ӑна 4 эрнере Mfn2cKO теҫҫӗ. Вӗҫӗнче эпир 8 эрнене суйласа илтӗмӗр, ун чухне ПН сийӗ митохондри татӑкӗсем палӑрнӑ пулин те ҫаплах ҫирӗп пулнӑ (1В тата S1А ӳкерчӗксем). Пурӗ эпир 3013 белок шутласа кӑлартӑмӑр, вӗсенчен 22% яхӑн MitoCarta 2.0 аннотацийӗсем ҫинче никӗсленнӗ, вӗсем митохондри протеомине митохондри пек тунӑ (1Е ӳкерчӗк) (1Е ӳкерчӗк) (24). 8-мӗш эрнере тунӑ дифференциаллӑ ген экспрессийӗн анализӗ ҫакна кӑтартнӑ: мӗнпур белоксенчен 10,5% кӑна пысӑк улшӑнусем пулнӑ (1F ӳкерчӗк тата S1F ӳкерчӗк), вӗсенчен 195 белокӗ аялалла, 120 белокӗ ҫӳлелле йӗркеленнӗ (1F ӳкерчӗк). Ҫакна та палӑртмалла: ҫак даннӑйсен пуххин «инновациллӗ ҫул-йӗр анализӗ» дифференциаллӑ экспрессиленӗ генсем тӗпрен илсен ятарлӑ ылмашӑну ҫулӗсен чикӗленӗ пуххине кӗнине кӑтартать (1G ӳкерчӗк). Тӗлӗнмелле, OXPHOS тата кальци сигнализацийӗпе ҫыхӑннӑ ҫулсене чакарни ҫыхӑну ҫитменлӗхлӗ ПН-сенче митохондри дисфункцине пуҫарса янине ҫирӗплетет пулин те, ытти категорисем, тӗпрен илсен аминокислотӑсен ылмашӑвне явӑҫтараканскерсем, палӑрмаллах ҫӳлелле йӗркеленеҫҫӗ, ку вара митохондри ПН-ӗсенче пулакан ылмашӑнупа килӗшсе тӑрать. Ҫӗнӗрен ҫыхӑнтарасси пӗр пек. дисфункци.
(А) CTRL тата Mfn2cKO шӑшисен пуҫ мимин пайӗсен репрезентативлӑ конфокаллӑ сӑнӳкерчӗкӗсем, вӗсем PN-сен ӳссе пыракан ҫухалӑвне кӑтартаҫҫӗ (калбиндин, сӑрӑ); ядросене DAPI-па хирӗҫле сӑрланӑ. (B) (A) виҫи (дисперсин пӗр енлӗ анализӗ, ***P<0.001; n = виҫӗ шӑширен 4-6 ҫаврашка). (C) Эксперименталлӑ ӗҫ юхӑмӗ. (D) Пуркинье (ҫӳлте) тата ытти клетка тӗсӗсем (вӑтам) валли ятарлӑ маркерсен ӑшӑ картти пайланӑвӗ. (Е) Венн диаграмми, вӑл классификациленӗ ПН-ра тупнӑ митохондри белокӗсен шутне кӑтартать. (F) 8 эрнере Mfn2cKO нейронӗсенчи дифференциаллӑ экспрессиленӗ белоксен вулкан графикӗ (1,3 пӗлтерӗшлӗ чикӗ хакӗ). (G) Пултарулӑх ҫулӗн анализӗ Mfn2cKO PN-ра 8 эрне тесе уйӑрнӑ пилӗк чи пӗлтерӗшлӗ ҫӳлелле (хӗрлӗ) тата аялалла (кӑвак) ҫул-йӗре кӑтартать. Кашни тупнӑ белокӑн вӑтам экспресси шайне кӑтартнӑ. Сӑрӑ тӗслӗ ӑшӑ картти: тӳрлетнӗ Р хакӗ. ns, пӗлтерӗшлӗ мар.
Протеомика кӑтартӑвӗсем I, III тата IV комплекссен белок экспрессийӗ майӗпен чакнине кӑтартнӑ. I, III тата IV комплекссенче пурте мтДНК-па кодланӑ кирлӗ субединицисем пулнӑ, II комплекс вара, ядерлӑ кодпа кӑна пулнӑскер, тӗпрен илсен нимӗнле витӗм те кӳмен (2А тата S2А ӳкерчӗксем). . Протеомика результачӗсемпе килӗшӳллӗн, пуҫ миминчи ткань пайӗсен иммуногистохимийӗ ҫакна кӑтартнӑ: ПН-ра IV комплексӑн MTCO1 (митохондри цитохром С оксидаза субединици 1) субединици шайӗ майӗпен чакнӑ (2В ӳкерчӗк). mtDNA-кодланӑ Mtatp8 субединици палӑрмаллах чакнӑ (S2A ӳкерчӗк), ҫав вӑхӑтрах ядерлӑ кодланӑ АТФ-синтаза субединицин стационарлӑ шайӗ улшӑнман, ку вара mtDNA экспрессийӗ стабиллӗ чухне паллӑ стабиллӗ АТФ-синтаза подсборки F1 комплексӗпе килӗшсе тӑрать. Формировани ҫирӗп. Пӳл (7). Сортланӑ Mfn2cKO PN-сенчи mtDNA шайне чӑн-чӑн вӑхӑтри полимеразӑллӑ сӑнчӑр реакцийӗпе (qPCR) хаклани mtDNA копийӗсен шучӗ майӗпен чакнине ҫирӗплетнӗ. Контроль ушкӑнӗпе танлаштарсан, 8 эрнере мтДНК шайӗн 20% яхӑн ҫеҫ сыхланса юлнӑ (2С ӳкерчӗк). Ҫак кӑтартусемпе килӗшӳллӗн, ДНК-на тупма Mfn2cKO PN-сене конфокаллӑ микроскоппа сӑрлани митохондри нуклеотидӗсен вӑхӑтран килекен ҫивӗчлӗхне кӑтартать (2D ӳкерчӗк). Эпир ҫакна тупрӑмӑр: митохондри белокӗсене ҫӗмӗрме тата стресс хуравне хутшӑнакан хӑш-пӗр кандидатсем ҫеҫ ҫӳлелле йӗркеленнӗ, ҫав шутра Lonp1, Afg3l2 тата Clpx, тата OXPHOS комплекс пухмалли факторсем. Апоптоз ӗҫне хутшӑнакан белоксен шайӗнче пысӑк улшӑнусем пулман (S2B ӳкерчӗк). Ҫавӑн пекех эпир кальцие куҫарма хутшӑнакан митохондрисемпе эндоплазма ретикулумӗн каналӗсенче пӗчӗк улшӑнусем кӑна пулнине тупрӑмӑр (S2C ӳкерчӗк). Унсӑр пуҫне, аутофагипе ҫыхӑннӑ белоксене хакланӑ чухне пысӑк улшӑнусем тупайман, ку вара иммуногистохимипе тата электрон микроскопийӗпе in vivo сӑнанӑ аутофагосомӑсен курӑнакан индукцийӗпе килӗшсе тӑрать (S3 ӳкерчӗк). Анчах та ПН-сенчи OXPHOS аталанса пыракан дисфункцийӗ митохондрисен ультраструктурӑллӑ улшӑнӑвӗсемпе пӗрле пырать. Митохондри кластерӗсене 5 тата 8 эрнери Mfn2cKO PN-сен клетка кӗлеткисенче тата дендрит йывӑҫҫисенче курма пулать, шалти мембрана тытӑмӗ тарӑн улшӑнусем тӳссе курнӑ (S4, А тата В ӳкерчӗксем). Ҫак ультраструктурӑллӑ улшӑнусемпе тата мтДНК палӑрмаллах чакнипе килӗшӳллӗн, ҫивӗч пуҫ мимин татӑкӗсене тетраметилродамин метил эфирӗпе (TMRM) анализ туни Mfn2cKO PN-сенчи митохондри мембранин потенциалӗ палӑрмаллах чакнине кӑтартнӑ (S4C ӳкерчӗк).
(А) OXPHOS комплексӗн экспресси шайӗн вӑхӑт тапхӑрӗн анализӗ. эрнере P<0,05 пулнӑ белоксене ҫеҫ шута илмелле (икӗ енлӗ ANOVA). Пӑнчӑллӑ йӗр: CTRL-па танлаштарсан нимӗнле тӳрлетӳ те ҫук. (B) Сулахайра: анти-MTCO1 антителапа паллӑ тунӑ пуҫ мимин пайӗн тӗслӗхӗ (шкала йӗрӗ, 20 мкм). Пуркинье клеткисен кӗлеткисем йышӑннӑ лаптӑк сарӑ тӗспе витӗннӗ. Сылтӑмра: MTCO1 шайне виҫесси (дисперсин пӗр енлӗ анализӗ; n = 7-20 клетка виҫӗ шӑширен анализланӑ). (C) qPCR анализ mtDNA копийӗсен шутне сортланӑ PN-ра (дисперсин пӗр енлӗ анализӗ; n = 3-7 шӑши). (D) Сулахайра: анти-ДНК антителапа паллӑ тунӑ пуҫ мимин татӑкӗн тӗслӗхӗ (шкала йӗрӗ, 20 мкм). Пуркинье клеткисен кӗлеткисем йышӑннӑ лаптӑк сарӑ тӗспе витӗннӗ. Сылтӑмра: мтДНК аманӑвӗсен шутне палӑртасси (дисперсин пӗр енлӗ анализӗ; n = виҫӗ шӑширен 5-9 клетка). (E) Пӗтӗм клеткӑллӑ патч-кламп ҫырӑвӗнче mitoYFP + Purkinje клеткисене (стрелка) кӑтартакан ҫивӗч пуҫ мимин пайӗн тӗслӗхӗ. (F) IV кукӑрӑн виҫи. (G) CTRL тата Mfn2cKO Пуркинье клеткисенче деполяризацилекен ток кӗртнин репрезентативлӑ ҫырӑвӗсем. Ҫӳлти йӗр: АП-на пуҫарса янӑ пӗрремӗш импульс. Аялти йӗр: чи пысӑк АП частота. (H) Постсинаптикӑллӑ хӑй тӗллӗн пулакан кӗртӳсене (sPSPs) шутласа кӑларасси. Репрезентативлӑ ҫыру йӗрӗ тата унӑн масштаб шайӗ (I) ӳкерчӗкре кӑтартнӑ. Пӗр енлӗ дисперси анализӗ виҫӗ шӑширен n = 5-20 клеткӑна анализланӑ. Даннӑйсене вӑтам±SEM пек кӑтартнӑ; *Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001. (J) Перфорированнӑй патч-кламп режимӗпе усӑ курса ҫырса илнӗ хӑй тӗллӗн пулакан АП-н репрезентативлӑ йӗрӗсем. Ҫӳлти йӗр: чи пысӑк АП частота. Аялти йӗр: пӗр АП-ӑн масштабӗ. (K) (J) тӑрӑх вӑтам тата чи пысӑк АП часлӑхне шутласа кӑларӑр. Манн-Уитни тӗрӗслевӗ; n = 5 клеткӑна тӑватӑ шӑширен анализланӑ. Даннӑйсене вӑтам±SEM пек кӑтартнӑ; пӗлтерӗшлӗ мар.
эрнери Mfn2cKO PN-ра OXPHOS палӑрмаллах сиенленнине тупса палӑртнӑ, ҫакӑ нейронсен физиологи функцийӗ питӗ йӗркесӗр пулнине пӗлтерет. Ҫавӑнпа та эпир OXPHOS-дефицитлӑ нейронсен пассивлӑ электричество характеристикисене 4-5 эрнере тата 7-8 эрнере ҫивӗч пуҫ мимин татӑкӗсенче пӗтӗм клеткӑллӑ патч-кламп ҫырӑвӗсене туса тишкертӗмӗр (2Е ӳкерчӗк). Кӗтмен ҫӗртен, Mfn2cKO нейронӗсен вӑтам кану мембранин потенциалӗ тата кӗртӳ резистентлӑхӗ контрольпе пӗр пек пулнӑ, анчах та клеткӑсем хушшинче вӑрттӑн уйрӑмлӑхсем пулнӑ (1-мӗш табл.). Ҫавӑн пекех 4-5 эрнере токпа напряжени хушшинчи ҫыхӑнура (IV йӗр) пысӑк улшӑнусем пулман (2F ӳкерчӗк). Анчах та 7-8 эрнери Mfn2cKO нейронӗсем IV режима (гиперполяризаци тапхӑрӗ) чӑтса ирттереймен, ҫакӑ вара ҫак кая юлнӑ тапхӑрта гиперполяризаци потенциалне уҫҫӑн сисӗмлӗ пулнине кӑтартать. Унпа танлаштарсан, Mfn2cKO нейронсенче тепӗр хут пулакан ӗҫ потенциалӗн (AP) разрядӗсене кӑларса тӑратакан деполяризацилекен юхӑмсем лайӑх чӑтса тӑраҫҫӗ, ҫакӑ вӗсен пӗтӗмӗшле разряд йӗркисем 8 эрнери контроль нейронӗсеннинчен палӑрмаллах уйрӑлса тӑманнине кӑтартать (1-мӗш табл. тата 2G ӳкерчӗк). Ҫавӑн пекех, хӑй тӗллӗн пулакан постсинаптикӑллӑ юхӑмсен (sPSCs) тӑтӑшлӑхӗпе амплитудине контроль ушкӑнӗнчипе танлаштарма пулать, ҫавӑн пекех пулӑмсен тӑтӑшлӑхӗ 4 эрнерен пуҫласа 5 эрне таран, 7 эрнерен пуҫласа 8 эрне таран ӳснӗ, ҫавӑн пекех ӳснӗ (2-мӗш ӳкерчӗк, H тата I). ПН-сенче синаптикӑлла пиҫӗхӳ тапхӑрӗ (25). Ҫакӑн пек результатсем шӑтарнӑ ПН-сен патчӗсем хыҫҫӑн та пулнӑ. Ку конфигураци клеткӑри АТФ ҫитменлӗхӗсене саплаштарма май парать, ҫакӑ пӗтӗм клеткӑллӑ патч-клампа ҫырса илнӗ чухне пулма пултарать. Уйрӑмах Mfn2cKO нейронсен каннӑ чухнехи мембрана потенциалӗ тата хӑй тӗллӗн персе ямалли час-часлӑхӗ витӗм кӳмен (2-мӗш ӳкерчӗк, J тата K). Пӗтӗмлетсе каласан, ҫак кӑтартусем OXPHOS дисфункцийӗ палӑракан ПН-сем пысӑк ҫивӗчлӗхлӗ разряд йӗркисене лайӑх чӑтса ирттерме пултарнине кӑтартаҫҫӗ, ҫакӑ вӗсене йӗркеллӗ электрофизиологи хуравӗсене тытса тӑма май паракан компенсаци механизмӗ пуррине кӑтартать.
Даннӑйсене вӑтам ± SEM (дисперсин пӗр енлӗ анализӗ, Холм-Сидакӑн нумай хутлӑ танлаштару тӗрӗслевӗ; *Р<0,05) пек кӑтартнӑ. Единица номерне скобкӑсенче кӑтартнӑ.
Эпир протеомика даннӑйӗсен пуххинчи мӗнле те пулин категорире (1G ӳкерчӗк) йывӑр OXPHOS ҫитменлӗхне хирӗҫ тӑма пултаракан ҫулсем пуррипе ҫуккине тӗпчеме пуҫларӑмӑр, ҫапла вара мӗншӗн чирлӗ PN йӗркеллӗ электрофизиологие тытса тӑма пултарнине ӑнлантарса патӑмӑр (2-мӗш ӳкерчӗк, E-ран пуҫласа K таран). . Протеомика анализӗ ҫакна кӑтартнӑ: туратлӑ сӑнчӑрлӑ аминокислотӑсен (BCAA) катаболизмне хутшӑнакан ферментсем палӑрмаллах ӳснӗ (3А тата S5А ӳкерчӗксем), юлашки продукт ацетил-КоА (КоА) е сукцинил КоА артериосклероз кислоти (TCA) циклӗнчи трикарбоксилатсене хушма пултарать. Эпир BCAA трансаминаза 1 (BCAT1) тата BCAT2 иккӗшӗ те ӳснине тупрӑмӑр. Вӗсем α-кетоглутаратран глутамат туса кӑларса BCAA катаболизмӗн пӗрремӗш тапхӑрне катализланӑ (26). Туратлӑ сӑнчӑрлӑ кето-кислота дегидрогеназа (BCKD) комплексне йӗркелекен пур субединицисем те ҫӳлелле йӗркеленеҫҫӗ (комплекс BCAA углерод скелетӗн каярахри тата каялла таврӑнми декарбоксилированине катализлать) (3А тата S5А ӳкерчӗксем). Анчах та сортланӑ PN-ра BCAA-ра хӑйӗн паллӑ улшӑнӑвӗсем тупӑнман, ку вара ҫак кирлӗ аминокислотӑсене клеткӑсем ытларах йышӑннипе е TCA циклне хушма ытти ҫӑлкуҫсемпе (глюкоза е сӗт кислоти) усӑ курнипе пулма пултарать (S5B ӳкерчӗк). OXPHOS ҫук PN-сем те 8 эрнере глутамин ҫӗмӗрӗлӗвӗпе трансаминаци активлӑхӗ ӳснине кӑтартнӑ, ҫакна митохондри ферменчӗсен глутаминаза (GLS) тата глутамин пируват трансаминаза 2 (GPT2) ҫӳлелле ҫӗкленнипе палӑртма пулать (3-мӗш ӳкерчӗк, А тата С). Ҫакна та палӑртмалла: GLS-ӑн ҫӳлелле хӑпарасси сплайсланӑ изоформӑллӑ глутаминаза С (GLS-GAC) ҫеҫ (Mfn2cKO/CTRL улшӑнӑвӗ 4,5 хут яхӑн, P = 0,05), унӑн рак тканӗсенче уйрӑм ҫӳлелле хӑпарасси митохондри биоэнергине пулӑшма пултарать. (27).
(А) Ӑшӑ картти 8 эрнере палӑртнӑ ҫулпа белок шайӗн хут улшӑнӑвне кӑтартать. (B) Анти-PCx антителапа паллӑ тунӑ пуҫ мимин татӑкӗн тӗслӗхӗ (шкала йӗрӗ, 20 мкм). Сарӑ стрелка Пуркинье клеткин ӳтне кӑтартать. (C) Атеросклерозӑн пӗлтерӗшлӗ кандидатӗ пулса тӑракан белок экспрессийӗн анализӗ (нумай t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 шӑши). (D) Ҫӳлте: [1-13C]пируват йӗрлевҫинче (т. е. PDH е трансартериаллӑ ҫулпа) пур паллӑланӑ углерода кӗмелли тӗрлӗ майсене кӑтартакан схема. Аялта: скрипка диаграмми ҫинче ҫивӗч пуҫ миминчи татӑксене [1-13C]пируватпа паллӑ тунӑ хыҫҫӑн аспарагин, лимон тата яблочнӑй кислотӑна куҫнӑ пӗр хутлӑ углеродӑн (M1) процентне кӑтартнӑ (мӑшӑрлӑ t-тест; ** P <0,01). (Е) Кӑтартнӑ ҫулӑн вӑхӑт историйӗн пур енлӗ анализӗ. эрнере P<0,05 пулнӑ белоксене ҫеҫ шута илмелле. Пунктирлӑ йӗр: тӳрлетӳ хакӗ ҫук (дисперсин икӗ енлӗ анализӗ; * Р <0,05; *** Р <0,001). Даннӑйсене вӑтам±SEM пек кӑтартнӑ.
Пирӗн анализ тӑрӑх, BCAA катаболизмӗ ҫӳлелле ҫӗкленмелли тӗп ҫулсенчен пӗри ​​пулса тӑчӗ. Ку факт OXPHOS ҫук PN-ра TCA циклне кӗрекен вентиляци калӑпӑшӗ улшӑнма пултарнине ҫирӗппӗн палӑртать. Ку нейронсен ылмашӑнӑвӗн тӗп форми пулма пултарать, вӑл йывӑр OXPHOS дисфункцине тытса тӑнӑ вӑхӑтра нейронсен физиологине тата пурнӑҫне тӳрремӗнех витӗм кӳме пултарать. Ҫак гипотезӑпа килӗшӳллӗн эпир атеросклероза хирӗҫ кӗрешекен тӗп фермент PCx ҫӳлелле йӗркеленнине тупрӑмӑр (Mfn2cKO/CTRL 1,5 хут яхӑн улшӑнать; 3А ӳкерчӗк), ҫакӑ пирувата оксалоацетата куҫарассине катализлать (28), ҫакӑ пуҫ миминчи тканьсенче астроцитсен экспрессине чакарать тесе шутлаҫҫӗ (29, 30). Протеомика результачӗсемпе килӗшӳллӗн, конфокаллӑ микроскопи PCx экспрессийӗ OXPHOS-дефицитлӑ PN-сенче ятарласа тата палӑрмаллах ӳснине, ҫав вӑхӑтрах PCx реактивлӑхӗ ытларах контрольӗн юнашар Бергманн глиаллӑ клеткисемпе ҫеҫ чикӗленнине кӑтартнӑ (3-мӗш ӳкерчӗк, В). PCx-ӑн сӑнанӑ ӳсӗмне функциллӗ тӗрӗслес тесе эпир ҫивӗч пуҫ мимин татӑкӗсене [1-13C]пируват йӗрӗпе имҫамларӑмӑр. Пируват пируват дегидрогеназӑпа (PDH) окисленнӗ чухне унӑн изотоп палли ҫухалнӑ, анчах та пируват юн тымарӗсен реакцийӗсемпе ылмашӑннӑ чухне вӑл TCA циклӗн вӑтам пайӗсене кӗрет (3D ӳкерчӗк). Пирӗн протеомика даннӑйӗсене ҫирӗплетсе эпир Mfn2cKO татӑкӗсен аспартат кислотинче ҫак следовательтен маркерсен пысӑк йышне асӑрхарӑмӑр, ҫав вӑхӑтрах лимон кислотипе яблочнӑй кислотӑсен те вӑтам тенденци пулнӑ, анчах вӗсем пӗлтерӗшлӗ мар (3D ӳкерчӗк).
MitoPark шӑшисен дофамин нейронӗсенче, дофамин нейронӗсем митохондри транскрипци факторӗн А генне (Tfam) ятарласа пӗтернипе ҫыхӑннӑ митохондри дисфункцийӗпе (S6B ӳкерчӗк) PCx экспрессийӗ те палӑрмаллах ӳснӗ (31), ҫакӑ ацетон кислоти артериосклерозӗ пулнине кӑтартать. ОКСФОС организмра. Ҫакна палӑртмалла: артериосклерозпа ҫыхӑннӑ нейронсенче экспрессиленме пултаракан хӑйне евӗрлӗ ферментсем (32-34) OXPHOS ҫук ПН-сенче палӑрмаллах ӳссе пынине тупса палӑртнӑ, сӑмахран, пропионил-КоА карбоксилаза (PCC-A), Малонил-КоА пропионил-КоА митоколина тата сукцинол-КоА митоколинне куҫарать фермент 3 (ME3), унӑн тӗп ӗҫӗ — малатран пируват кӑларасси (3-мӗш ӳкерчӗк, А тата С) (33, 35). Унсӑр пуҫне, эпир Pdk3 ферментӑн палӑрмаллах ӳснине тупрӑмӑр, вӑл PDH-на фосфориллет тата ҫапла майпа инактивацилет (36), ҫав вӑхӑтрах PDH-на активизацилекен Pdp1 ферментра е PDH фермент комплексӗнче хӑйӗнче нимӗнле улшӑну та тупса палӑртман (3А ӳкерчӗк). Ҫакна май Mern2cKO PN-сенче Ser293-ри PDH комплексӗн пируватдегидрогеназа E1 компоненчӗн α1 субединици α (PDHE1α) субединицин фосфорилированине (PDH фермент активлӑхне чакарни паллӑ) вӑйлатнӑ (S6C ӳкерчӗк) (S6C ӳкерчӗк). Пируват юн тымарӗсене кӗме пултараймасть.
Юлашкинчен, эпир серинпа глицин биосинтезӗн суперҫулӗ, ҫыхӑннӑ митохондри фолат (1С) циклӗ тата пролин биосинтезӗ (1G тата S5C ӳкерчӗксем) пурте, отчетсем тӑрӑх, активаци процесӗнче палӑрмаллах ӳссе пынине тупрӑмӑр. Таврари тканьсем митохондри дисфункцийӗпе активизациленеҫҫӗ (5-7). Ҫак протеомика даннӑйӗсене ҫирӗплетекен конфокаллӑ анализ ҫакна кӑтартнӑ: OXPHOS ҫук PN-ра 8 эрнери шӑшисен пуҫ миминчи татӑкӗсене серин гидроксиметилтрансфераза 2 (SHMT2) — митохондри фолат циклӗн тӗп ферментӗ — ҫине лартнӑ. Пысӑк иммунлӑ хурав (S5D ӳкерчӗк). CU-глюкозӑпа инкубациленӗ ҫивӗч пуҫ миминчи татӑксенче метаболита йӗрлесе тупнӑ экспериментсем серинпа пролин биосинтезӗн ӳсӗмне ҫирӗплетнӗ, ҫакӑ серинпа пролин ҫине углерод изоформисен юхӑмӗ ӳснине кӑтартнӑ (S5E ӳкерчӗк). GLS тата GPT2 пулӑшакан реакцисем глутаминран глутамат синтезӗшӗн тата глутаматпа α-кетоглутарат хушшинчи трансаминацишӗн яваплӑ пулнӑран, вӗсен ӳсӗмӗ OXPHOS-дефицитлӑ нейронсен глутамат ыйтӑвӗ ӳснине пӗлтерет. Ҫак улшӑнусемпе танлаштарсан, PN-спецификлӑ Mfn2cKO шӑшисен пуҫ мимин астроцитӗсен протеомлӑ анализӗ ҫак ҫулсем (ҫав шутра пур антипероксидазӑсем те) экспрессире палӑрмаллах улшӑнманнине кӑтартнӑ, ҫапла вара Ҫак метаболита ҫӗнӗрен йӗркелесси ҫӗмӗрӗлнӗ PN еннелле суйласа илнине кӑтартнӑ (S6 ӳкерчӗк, D-ран G таран).
Пӗтӗмлетсе каласан, ҫак анализсем ПН-сенче ятарлӑ ылмашӑну ҫулӗсен вӑхӑтлӑх активизацийӗн палӑрмаллах тӗрлӗ йӗркисене тупса палӑртнӑ. Нейронсен митохондрийӗсен ӗҫӗ йӗркеллӗ мар пулсан та, малтанхи атеросклероз тата 1С ремоделировани (3Е тата S5С ӳкерчӗксем), I тата IV комплекссен экспрессийӗнче малтанах пӗлме пултаракан улшӑнусем пулма пултараҫҫӗ пулин те, серин de novo синтезӗнчи улшӑнусем каярахри тапхӑрсенче ҫеҫ палӑраҫҫӗ. OXPHOS дисфункцийӗ (3Е тата S5С ӳкерчӗксем). Ҫак тупӑшусем стресспа пулакан митохондри (1С цикл) тата цитоплазма (серин биосинтезӗ) нейронсен ылмашӑнӑвне улӑштарма ТСА циклӗнче атеросклероз ӳснипе пӗрле синергилле хуравлакан йӗркеллӗ процеса палӑртаҫҫӗ.
эрнери OXPHOS-дефицитлӑ PN-сем пысӑк ҫивӗчлӗхлӗ хумхану активлӑхне тытса тӑма пултараҫҫӗ тата митохондри дисфункцине саплаштарма пысӑк метаболита ҫӗнӗрен ҫыхӑнма пултараҫҫӗ. Ҫак тупӑшу ҫакӑн пек интереслӗ май кӑларса тӑратать: ҫак самантра та ҫак клеткӑсем нейродегенерацие вӑраха яма е асӑрхаттарма сиплев интервенцийӗ илме пултараҫҫӗ. Кайран. Ҫак майлӑха эпир икӗ никама пӑхӑнман интервенци урлӑ татса патӑмӑр. Пӗрремӗш меслетпе эпир Cre-зависимӑй адено-ассоциированнӑй вирус (AAV) векторне хатӗрлерӗмӗр, ҫапла вара MFN2 OXPHOS-дефицитлӑ PN-сенче in vivo суйласа илсе экспрессиленме пултарать (S7A ӳкерчӗк). MFN2 кодлакан AAV тата mCherry (Mfn2-AAV) флуоресцентлӑ репортер генне in vitro тӗп нейрон культурисенче тӗрӗсленӗ, ҫакӑ MFN2 Cre-зависимӑй майпа экспрессиленме май панӑ тата митохондри морфологине ҫӑлса хӑварнӑ, ҫапла майпа Mfn2cKO нейронӗсенче нейромутацие чарнӑ ( S7, D тата D ӳкерчӗксем). Унтан эпир 8 эрнери Mfn2-AAV-а Mfn2cKO тата контроль шӑшисен пуҫ мимине стереотактика мелӗпе илсе ҫитерме in vivo экспериментсем туса пӑхрӑмӑр, 12 эрнери шӑшисене анализларӑмӑр (4А ӳкерчӗк). Сипленӗ Mfn2cKO шӑшисем вилнӗ (1-мӗш ӳкерчӗк, А тата В) (16). Вирус трансдукцийӗ in vivo хӑш-пӗр пуҫ мимин ҫаврашкисенче PN суйласа илнӗ экспрессине кӑтартнӑ (S7, G тата H ӳкерчӗксем). mCherry (Ctrl-AAV) кӑна экспрессилекен контроль AAV инъекцийӗ Mfn2cKO чӗрчунсен нейродегенераци шайне пысӑк витӗм кӳмен. Унпа танлаштарсан, Mfn2-AAV трансдуциленӗ Mfn2cKOs анализӗ PN клетка сийӗн пысӑк хӳтӗлев витӗмне кӑтартнӑ (4-мӗш ӳкерчӗк, В тата С). Уйрӑмах нейронсен ҫӑра тӑвӑрлӑхӗ контроль чӗрчунӗсенчен уйрӑлса тӑмасть темелле (4-мӗш ӳкерчӗк, В тата С, тата S7, Н тата I ӳкерчӗксем). MFN1 экспрессийӗ, анчах MFN2 мар, нейронсен вилӗмне ҫӑлас ӗҫре пӗр пекех витӗмлӗ (4С ӳкерчӗк тата S7 ӳкерчӗк, C тата F), ҫакӑ эктопикӑллӑ MFN1 экспрессийӗ MFN2 ҫитменлӗхне витӗмлӗн хушма пултарнине кӑтартать. Пӗр PN шайӗнчи малаллахи анализ Mfn2-AAV митохондрисен ультраструктурине пысӑк шайра ҫӑлса хӑварнине, mtDNA шайне нормализациленине тата антиангиогенез маркерӗн PCx пысӑк экспрессине каялла тавӑрнине кӑтартнӑ (4-мӗш ӳкерчӗк, C-ран пуҫласа E таран). Ҫӑлӑннӑ Mfn2cKO шӑшисене каннӑ чухне куҫпа пӑхса тӗрӗсленӗ чухне вӗсен кӗлетки тата моторлӑ симптомӗсем (S1-S3 хускану) лайӑхланнине кӑтартнӑ. Пӗтӗмлетсе каласан, ҫак экспериментсем ҫакна кӑтартаҫҫӗ: OXPHOS питӗ ҫитменлӗхлӗ PN-сене MFN2-на каярахпа каялла кӗртни mtDNA ҫиессине каялла тавӑрма тата атеросклероз пуҫарма ҫителӗклӗ, ҫавна май аксонсен дегенерацийӗпе нейронсен вилӗмне in vivo сирсе ярать.
(А) Кӑтартнӑ метаболита ҫулне активизациленӗ чухне MFN2 кодлакан AAV инъекцийӗн эксперимент графикне кӑтартакан схема. (B) 12 эрнери пуҫ мимин пайӗсен репрезентативлӑ конфокаллӑ сӑнӳкерчӗкӗсем, вӗсене 8 эрнере Mfn2cKO шӑшисемпе трансдукциленӗ тата анти-Кальбиндин антителапа паллӑ тунӑ. Сылтӑмра: аксон ҫипписен масштабӗ. Аксонсен масштабӗ 450 тата 75 мкм. (C) Сулахайра: AAV трансдукци циклӗнче (AAV+) Пуркинье клеткисен ҫӑра тӑвӑрлӑхне виҫесси (дисперсин пӗр енлӗ анализӗ; n = 3 шӑши). Сылтӑмра: 12-мӗш эрнере трансдуциленӗ ПН-ра мтДНК фокус анализӗ (мӑшӑрланман t-тест; виҫӗ шӑширен n = 6 клетка). * Р <0,05; ** Р <0,01. (D) Кӑтартнӑ вирус векторӗсемпе трансдуциленӗ Mfn2cKO пуҫ мимин пайӗсен ПН-ӗсен репрезентативлӑ трансмисси электрон микрографийӗсем. Кӗрен маска дендритсем йышӑннӑ лаптӑка кӑтартать, сарӑ пӑнчӑллӑ тӑваткал вара сылтӑм енче панӑ масштаба кӑтартать; n — ядро. Шкала, 1 мкм. (Е) 12 эрнере трансдуциленӗ ПН-ра PCx тӗслӗхӗн тӗслӗхне кӑтартать. Шкала, 20 мкм. OE, ытлашши экспресси; ФК, хут улшӑнӑвӗ.
Юлашкинчен, эпир OXPHOS дисфункцине тӳссе курнӑ ПН-сенче пероксидазӑпа ҫыхӑннӑ клеткӑсен пурнӑҫӗн пӗлтерӗшне тӗпчерӗмӗр. Эпир mCherry кодлакан AAV-shRNA (кӗске шпилька РНК) генерацилерӗмӗр, вӑл шӑшисен PCx мРНК-не (AAV-shPCx) ятарласа тӗллев лартнӑ, вируса е унӑн скрамблланӑ контролне (AAV-scr) Mfn2cKO шӑшисен пуҫ мимине ятӑмӑр. PCx экспрессийӗ ӳснӗ тапхӑрта (3С ӳкерчӗк) тата PN клетка сийӗ ҫаплах ҫирӗп тӑнӑ тапхӑрта PCx эффективлӑ нокдаунне пурнӑҫлама инъекцие тӑваттӑмӗш эрнере (5А ӳкерчӗк) тунӑ (1А ӳкерчӗк). Ҫакна та палӑртмалла: PCx-а ҫӗмӗрни (S8A ӳкерчӗк) PN вилӗмӗн палӑрмаллах хӑвӑртлӑхӗ патне илсе пырать, ку вӑл инфекцин пӗртен-пӗр чикӗленӗ ҫаврашки шутланать (5-мӗш ӳкерчӗк, B тата C). PCx ҫӳлелле йӗркеленнипе пулакан ылмашӑну эффектӗсен механизмне ӑнланас тесе эпир PCx нокдаун хыҫҫӑн PN-сен редокс статусне тӗпчерӗмӗр тата AAV-медиациллӗ оптика биосенсорӗ Grx1-roGFP2 пӗр вӑхӑтрах экспрессиленнӗ (S8 ӳкерчӗк, B-ран D таран) глутатиона хаклама Redox пептидӑн относительнӑй улшӑнӑвне (838). Унтан эпир 7 эрнери Mfn2cKO е контроль йӑхӗн ҫивӗч пуҫ мимин татӑкӗсенче икӗ фотонлӑ флуоресценциллӗ пурнӑҫ тӑршшӗпе ӳкерекен микроскопи (FLIM) туса пӑхрӑмӑр, FLIM условийӗсене тӗрӗсленӗ хыҫҫӑн цитоплазмӑри редокс статусӗнче пулма пултаракан улшӑнусене тупса палӑртрӑмӑр (S8 ӳкерчӗк, E-ран G таран). Анализ PCx экспрессийӗ ҫук пӗр Mfn2cKO PN-ӑн окислени тӑрӑмӗ палӑрмаллах ӳснине кӑтартнӑ, ку вара контроль нейронӗсенчен е Mfn2cKO PN-сенчен уйрӑлса тӑрать, вӗсем скрамблланӑ shRNA кӑна экспрессилеҫҫӗ (5-мӗш ӳкерчӗк, D тата E). PCx экспрессине чакарнӑ чухне Mfn2cKO PN-сен пысӑк окисленнӗ тӑнӑҫлӑха кӑтартакан процент пайӗ виҫӗ хут ытла ӳснӗ (5Е ӳкерчӗк), ҫакӑ PCx ҫӳлелле йӗркеленни дегенерациленнӗ нейронсен редокс хӑватне тытса тӑнине кӑтартать.
(А) Кӑтартнӑ метаболита ҫулне активизациленӗ чухне shPCx кодлакан AAV инъекцийӗн эксперимент графикне кӑтартакан схема. (B) Mfn2cKO шӑшисен 8 эрнери пуҫ мимин пайӗсен репрезентативлӑ конфокаллӑ сӑнӳкерчӗкӗсем, вӗсене 4 эрнерен антикальциневин антителапа трансдукциленӗ тата паллӑ тунӑ. Шкала, 450 мкм. (C) AAV-трансдукциленӗ петлесенче Пуркинье клеткисен ҫӑра тӑвӑрлӑхне виҫесси (дисперсин пӗр енлӗ анализӗ; n = 3-4 шӑши). Даннӑйсене вӑтам±SEM пек кӑтартнӑ; ***Р<0,001. (D) Репрезентативлӑ FLIM ӳкерчӗкӗ 7 эрнери PN экспрессиленӗ глутатион редокс сенсорне Grx1-roGFP2 палӑртнӑ эксперимент условийӗсенче вӑтам пурнӑҫ тӑршшӗне кӑтартать. LUT (look-up table) шайлашӑвӗ: пурнӑҫ вӑхӑчӗн хушши (пикосекундпа). Шкала, 25 мкм. (E) Гистограмма (D)-ран Grx1-roGFP2 пурнӑҫ тӑршшӗнчи хаксен пайланӑвне кӑтартать (кашни условире икӗ шӑшире n=158-ран пуҫласа 368 клетка таран). Кашни гистограмма ҫийӗнчи диаграмма: CTRL-AAV-scr-ри вӑтам пурнӑҫ тӑршшӗн 1 SD-ран пысӑкрах пурнӑҫ тӑршшӗ палӑрмаллах вӑрӑмрах (хӗрлӗ, окисленнӗ) е кӗскерех (кӑвак, чакнӑ) клеткӑсен шутне кӑтартать. (F) Сӗннӗ модель нейронсен PCx-не ӳстерессин хӳтӗлев витӗмне кӑтартать.
Пӗтӗмӗшле илсен, эпир кунта панӑ даннӑйсем MFN2-н ҫӗнӗрен экспрессийӗ OXPHOS йывӑр ҫитменлӗхӗпе, mtDNA йывӑр чакнипе тата питӗ йӗркесӗр ista евӗрлӗ морфологипе аталаннӑ PN-а пӗтӗмпех ҫӑлса хӑварма пултарнине кӑтартаҫҫӗ, ҫавна май аталаннӑ чирсенче те тӑтӑшах аталанма май парать. Нейродегенераци клетка вилӗмӗ умӗнхи тапхӑрӑн каялла таврӑнакан кӑтартӑвӗсене парать. Ҫак шайри ылмашӑну ҫаврӑнӑҫулӑхӗ нейронсен атеросклероз (ТСА циклӗн ҫӗнӗрен ҫыхӑнӑвӗ) пуҫарма пултарнипе татах та палӑрать, вӑл OXPHOS ҫук ПН-сенче PCx экспрессине чарать тата клетка вилӗмне вӑйлатать, ҫавна май хӳтӗлев рольне вылять (5F ӳкерчӗк).
Ҫак тӗпчевре эпир OXPHOS дисфункцийӗ ҫине ПН-сен хуравӗ метаболита программисем активизациленӗ дифференциаллӑ активаци ҫулӗ урлӑ майӗпен ТСА циклӗн атеросклерозӗ патне ҫывхарнине кӑтартса патӑмӑр. Эпир протеом анализне нумай комплементарлӑ меслетсемпе ҫирӗплетрӗмӗр тата митохондрисен йывӑр дисфункцийӗпе ҫыхӑннӑ чухне нейронсен ылмашӑну ҫирӗплӗхӗн унччен паллӑ мар форми пуррине палӑртрӑмӑр. Эпир тӗлӗнсех кайрӑмӑр: пӗтӗм ҫӗнӗрен ҫыхӑнтармалли процесс нейродегенерацие майӗпен тата каялла тавӑрма ҫук майпа пӗрле пыракан вӗҫлӗ ылмашӑну тӑрӑмне палӑртмасть, анчах пирӗн даннӑйсем вӑл клетка вилӗмӗ умӗнхи тапхӑрта та тытса тӑракан нейрон пулма пултарнине палӑртаҫҫӗ. Функциллӗ компенсаци механизмӗ. Ку тупӑшу нейронсен организмра ылмашӑну пластичлӑхӗн пысӑк шайӗ пуррине кӑтартать. Ку факт каярахпа MFN2 ҫӗнӗрен кӗртни тӗп ылмашӑну маркерӗсен экспрессине каялла тавӑрма тата PN дегенерацине сирсе яма пултарнине ҫирӗплетет. Пачах урӑхла, вӑл атеросклероза чарать, нервсене хӑвӑртлатать. транссексуал.
Пирӗн тӗпчевӗн чи илӗртӳллӗ тупӑшӗсенчен пӗри ​​вӑл — OXPHOS ҫук ПН-сем артериосклероза ятарласа хавхалантаракан ферментсене ҫӳлелле йӗркелесе ТСА циклӗн ылмашӑвне улӑштарма пултараҫҫӗ. Метаболизм ҫӗнӗрен йӗркеленни — рак клеткисен пӗрлехи уйрӑмлӑхӗ, вӗсенчен хӑшӗ-пӗрисем ТСА циклӗн вӑтам продукчӗсене хушма глутамин ҫине шанаҫҫӗ, ҫапла вара сывлав сыпӑкне ертсе пыраҫҫӗ тата липидсемпе нуклеотидсен биосинтезӗн прекурсорӗсене туса кӑларассине тытса тӑраҫҫӗ (39 , 40). Нумаях пулмасть тунӑ тӗпчев ҫакна кӑтартнӑ: OXPHOS дисфункцийӗпе аптӑракан периферири тканьсенче глутамин/глутамат ылмашӑнӑвӗн ҫӗнӗрен ҫыхӑнӑвӗ те паллӑ паллӑ пулса тӑрать (5, 41), унта глутамин TCA циклне кӗмелли ҫул-йӗр OXPHOS суранӗн йывӑрлӑхӗнчен килет (41). ). Анчах та организмри нейронсен ылмашӑну пластичлӑхӗн пӗрпеклӗхӗ тата чир-чӗр контекстӗнче унӑн пӗлтерӗшӗ пулма пултарни ҫинчен уҫӑмлӑ ҫирӗплетӳсем ҫук. Нумаях пулмасть in vitro тӗпчевре пӗрремӗш кортикаллӑ нейронсем нейротрансмисси валли глутамат пулӗсене мобилизациленине кӑтартнӑ, ҫавна май метаболита стресс условийӗсенче оксидациллӗ ылмашӑнӑва тата атеросклероза аталантарнӑ (42). Ҫакна та палӑртмалла: ТСА циклӗн сукцинатдегидрогеназа ферментне фармакологи тӗлӗшӗнчен чарса лартнӑ чухне пируват карбоксилировани культурӑллӑ пуҫ мимин гранулӑллӑ нейронӗсенче оксалоацетат синтезне тытса тӑрать тесе шутлаҫҫӗ (34). Анчах та ҫак механизмсен пуҫ мимин тканьӗсемшӗн физиологи тӗлӗшӗнчен пӗлтерӗшӗ (унта атеросклероз ытларах астроцитсемпе ҫеҫ ҫыхӑннӑ тесе шутлаҫҫӗ) халӗ те пысӑк физиологи пӗлтерӗшлӗ (43). Ку тӗслӗхре пирӗн даннӑйсем ҫакна кӑтартаҫҫӗ: организмра OXPHOS сиенленӗ PN-сене BCAA ҫӗмӗрӗлӗвӗпе пируват карбоксилированине куҫарма пулать, вӗсем TCA пулӗн вӑтам продукчӗсене хушмалли икӗ тӗп ҫӑлкуҫ пулса тӑраҫҫӗ. BCAA катаболизмӗ нейронсен энерги ылмашӑвне мӗнле тӳпе хывнине сӗннӗ пулин те, нейротрансмиссире глутаматпа ГАМК мӗнле вырӑн йышӑннисӗр пуҫне (44), ҫак механизмсем in vivo ҫинчен нимӗнле ҫирӗплетӳ те ҫук-ха. Ҫавӑнпа та дисфункционаллӑ ПН-сем атеросклероз ӳстерсе ассимиляци процесӗпе ҫыхӑннӑ ТСА вӑтам продукчӗсене ҫинине автоматла майпа саплаштарма пултараҫҫӗ тесе шутлама ҫӑмӑл. Уйрӑмах, аспартат кислотине ыйтассине ӳстерме PCx шайне ӳстерме кирлӗ пулма пултарать, ҫакна митохондри дисфункцийӗпе пролиферацилекен клеткӑсенче кӑтартнӑ (45). Анчах та пирӗн метаболомика анализӗ Mfn2cKO PN-сенче аспартат кислотин стационарлӑ шайӗнче нимӗнле пысӑк улшӑну та кӑтартман (S6A ӳкерчӗк), ку вара, ахӑртнех, пролиферацилекен клеткӑсемпе митоз хыҫҫӑнхи нейронсем хушшинче аспартат кислотине метаболита тӗрлӗрен усӑ курнине кӑтартса парать. In vivo дисфункционаллӑ нейронсенче PCx ӳсӗмӗн тӗп механизмне палӑртмалла пулин те, эпир ҫак вӑхӑтсӑр хурав нейронсен редокс тӑрӑмне тытса тӑрас ӗҫре пысӑк вырӑн йышӑннине кӑтартрӑмӑр, ҫакна FLIM эксперименчӗсенче пуҫ мимин татӑкӗсем ҫинче кӑтартнӑ. Уйрӑмах, PN-сене PCx-а ҫӳлелле йӗркелеме чарни ытларах окисленнӗ тӑрӑма илсе пыма тата клетка вилӗмне хӑвӑртлатма пултарать. BCAA ҫӗмӗрӗлӗвӗн активизацийӗ тата пируват карбоксилированийӗ митохондри дисфункцийӗн перифериллӗ тканьӗсене палӑртмалли майсем мар (7). Ҫавӑнпа та вӗсем OXPHOS-дефицитлӑ нейронсен приоритетлӑ палли пек туйӑнаҫҫӗ, нейродегенерацишӗн пӗлтерӗшлӗ пӗртен-пӗр паллӑ мар пулин те. .
Пуҫ мимин чирӗ — нейродегенеративлӑ чирӗн гетерогенлӑ тӗсӗ, вӑл ытларах чухне атакси пек палӑрать тата час-часах ПН-сене сиенлет (46). Ҫак нейронсен популяцийӗ митохондри дисфункцийӗшӗн уйрӑмах хӑрушӑ, мӗншӗн тесен вӗсен шӑшисенче суйласа илнӗ дегенерацийӗ этемӗн спиноцеребелляр атаксине палӑртакан нумай моторлӑ симптомсене ҫӗнӗрен ҫуратма ҫителӗклӗ (16, 47, 48). Пӗлтерӳсем тӑрӑх, мутантлӑ генлӑ трансгенлӑ шӑши моделӗ этем спиноцеребелляр атаксипе ҫыхӑннӑ тата митохондри дисфункцийӗ пур (49, 50), ҫакӑ PNPH-ра OXPHOS ҫитменлӗхӗн ҫивӗчлӗхне тӗпчессин пӗлтерӗшне палӑртать. Ҫавӑнпа та ҫак хӑйне евӗрлӗ нейронсен популяцине витӗмлӗн уйӑрса илме тата тӗпчеме уйрӑмах юрӑхлӑ. Анчах та, ПН-сем пусӑма питӗ сисӗмлӗ пулнине тата пӗтӗм пуҫ мимин клеткисен популяцийӗн пӗчӗк пайне йышӑннине шута илсен, омиксем ҫинче никӗсленнӗ нумай тӗпчевсемшӗн вӗсене пӗтӗм клеткӑсем пек суйласа уйӑрасси ҫаплах йывӑрлӑх кӑларса тӑратать. Ытти клетка тӗсӗсене (уйрӑмах ҫитӗннӗ ҫынсен тканьӗсене) пачах та варалама май ҫукпа пӗрех пулин те, эпир эффективлӑ диссоциаци тапхӑрне FACS-па пӗрлештерсе ҫителӗклӗ таран пурӑнма пултаракан нейронсем илме пултартӑмӑр, ҫавӑн пекех пӗтӗм пуҫ миминчи даннӑйсен пуххипе танлаштарсан, вӗсен белок шайӗ (3000 яхӑн белок) пур (15). Пӗтӗм клеткӑсен пурнӑҫлӑхне упраса хӑварса эпир кунта панӑ меслет пире митохондрисенчи ылмашӑну ҫулӗсен улшӑнӑвӗсене тӗрӗслеме кӑна мар, унӑн цитоплазма аналогӗсен улшӑнӑвӗсене те тӗрӗслеме май парать, ҫакӑ вара клетка типӗсемшӗн уйрӑм митохондрисен мембранин ярлыкне пуянлатассине тултарать. Эпир ҫырса кӑтартнӑ меслет Пуркинье клеткисене тӗпчессипе ҫеҫ ҫыхӑнман, ӑна чирлӗ пуҫ миминчи ылмашӑну улшӑнӑвӗсене, ҫав шутра митохондри дисфункцийӗн ытти моделӗсене те, татса пама кирек мӗнле клетка тӗсӗпе те ҫӑмӑллӑнах усӑ курма пулать.
Юлашкинчен, эпир ҫак ылмашӑну ҫӗнӗрен йӗркеленӗвӗн процесӗнче сиплев чӳречине тупса палӑртрӑмӑр, вӑл клеткӑсен стрессӗн тӗп паллисене пӗтӗмпех каялла тавӑрма тата нейронсен дегенерацине сирсе яма пултарать. Ҫавӑнпа та кунта ҫырса кӑтартнӑ ҫӗнӗрен ҫыхӑнтарнин функциллӗ пӗлтерӗшне ӑнланни митохондри дисфункцийӗ вӑхӑтӗнче нейронсен пурнӑҫлӑхне упраса хӑвармалли майсем ҫинчен тӗп ӑнланусем пама пултарать. Ҫак принципа ытти неврологи чирӗсемпе усӑ курма май пуррине туллин уҫса пама ытти пуҫ мимин клеткисен энерги ылмашӑнӑвӗн улшӑнӑвӗсене тишкерме тӗллев лартнӑ малашнехи тӗпчевсем кирлӗ.
MitoPark шӑшисене маларах та ҫырса кӑтартнӑ (31). C57BL/6N шӑшисене loxP фланкинг Mfn2 генӗсемпе маларах ҫырса кӑтартнӑ (18) тата L7-Cre шӑшисемпе хӗресленӗ (23). Ҫак икӗ хутлӑ гетерозиготӑллӑ ӑрӑва вара гомозиготӑллӑ Mfn2loxP/Mfn2loxP шӑшисемпе хӗресленӗ те Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) валли Пуркинье-спецификлӑ ген нокаутӗсем туса кӑларнӑ. Мӑшӑрланӑвӑн пӗр пайӗнче Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP аллелне (stop-mtYFP) хушма хӗрессем урлӑ кӗртнӗ (20). Пур чӗрчун процедурисене те Европӑри, наци тата учрежденисен йӗркисемпе килӗшӳллӗн тунӑ тата Германири Ҫурҫӗр Рейн-Вестфалири Umwelt тата Verbraucherschutz хулисенчи LandesamtfürNatur ҫирӗплетнӗ. Чӗрчунсемпе ӗҫлесси те Европӑри лабораторири чӗрчунсен наукисен ассоциацийӗсен федерацийӗн ертсе пынине пӑхӑнать.
Ача ҫуратакан хӗрарӑмӑн мӑй шӑмми ҫурӑлнине наркоз панӑ хыҫҫӑн шӑши эмбрионне уйӑраҫҫӗ (Е13). Кортекса 10 мМ Hepes хушнӑ Хэнксӑн шайлашуллӑ тӑвар ирӗлчӗкӗнче (HBSS) уйӑрнӑ та папаин (20 Е/мл) тата цистеин (1 мкг/мл) хушнӑ Dulbecco's Modified Eagle's Medium ҫине куҫарнӑ. Ткансене ДМЭМра инкубацилемелле) тата ӑна ферментлӑ ирӗлтерсе уйӑрмалла. Ml) 37°C температурӑра 20 минут хушши, унтан 10% ӗне ҫуратмалли сывлавпа хушнӑ ДМЭМра механически авӑртнӑ. Клеткӑсене полилизинпа сӑрланӑ кӗленче хупӑлчисем ҫине 6 см культура савӑтне 2×106 ҫӑра е 0,5×105 клетка/см2 ҫӑра ҫӑра анализ тума лартнӑ. сехетрен ҫав хутлӑха 1% B27 хушмалли тата 0,5 мМ GlutaMax хушнӑ Neurobasal сывороткӑсӑр хутӑшпа улӑштарнӑ. Унтан нейронсене эксперимент вӑхӑтӗнче 37°C тата 5% CO2 температурӑра тытнӑ, эрнере пӗрре апатлантарнӑ. In vitro рекомбинацие пуҫарса яма 3 мкл (24 лункӑллӑ культура тарелки) е 0,5 мкл (24 лункӑллӑ пластинка) ҫак AAV9 вирус векторӗпе in vitro иккӗмӗш кунне нейронсене имҫамлама усӑ курнӑ: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, каталог номерӗ 105530-AAV9) тата AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, каталог номерӗ 105545-AAV9).
Шӑшисен Mfn1 тата Mfn2 комплементарлӑ ДНК-не (Addgene плазмиди #23212 тата #23213-ран илнӗ) C-вӗҫӗнче V5 йӗркипе (GKPIPNPLLGLDST) паллӑ тунӑ, вӗсене T2A йӗрки урлӑ mCherry-па пӗрлештернӗ. Grx1-roGFP2 — Гейдельберг ТП Дик ДФКЗ (Deutsches Krebsforschungszentrum) парни. tdTomato кассетӑна йӑлана кӗнӗ клонировани меслечӗсемпе улӑштарса, кассетӑна pAAV-CAG-FLEX-tdTomato ҫурӑм шӑммине (Addgene 28306 номерлӗ) субклонланӑ, ҫапла майпа pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-CAG FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 тата pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 векторӗсем. Ҫакӑн пек стратегипе pAAV-CAG-FLEX-mCherry контроль векторне генерировать тума усӑ курнӑ. AAV-shPCx конструкцине генерировать тума плазмидӑллӑ AAV векторӗ (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) кирлӗ, унта шӑши PCx-не таргетинглакан shRNA-на кодлакан ДНК йӗрки пур (5′CTTTCGCTACCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAAGGACTTAGACTTAGA 3′) U6 промоторӗн контролӗ айӗнче mCherry CMV промоторӗн контролӗ айӗнче усӑ кураҫҫӗ. Пулӑшу ААВ векторӗсене туса кӑларассине производитель инструкцийӗ тӑрӑх (Cell Biolabs) туса пынӑ. Кӗскен каласан, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) куҫӑмлӑ плазмидӑпа усӑ курӑр. mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) е Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) кодлакан ген, ҫавӑн пекех кодлакан AAV1 капсид белокӗ тата хушма белок кодлакан плазмидӑллӑ плазмид, кальци фосфат мелӗпе усӑ курса. Чӗрӗ вирус супернатантне типӗ пӑр/этанол ваннинче шӑнтмалли-ирӗлтермелли циклсемпе тата клеткӑсене фосфатлӑ буферлӑ тӑварлӑ шывра (PBS) лизланӑ. AAV векторне татӑк-кӗсӗк йодиксанол градиентлӑ ультрацентрифугӑпа (24 сехет 32 пин ҫаврӑм/мин тата 4°C) тасатнӑ та Amicon ультра-15 центробежнӑй фильтрпа усӑ курса концентратланӑ. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 геном копийӗ (GC)/мл], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/мл), AAV1-CAG-FLEX геномӗн титрӗ малтан ҫырса кӑтартнӑ пек пулнӑ (ПЦР-па виҫнӗ 45), виҫнӗ 5-мӗш q -MFN1-V5 (1,9×1013 ГК/мл) тата AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 ГК/мл).
Пӗрремӗш нейронсене пӑр пек сивӗ 1x PBS-ра хырса кӑларнӑ, пеллетланӑ, унтан 0,5% Triton X-100 / 0,5% натрий дезоксихолат/PBS лизис буферӗнче фосфатазӑпа протеаза ингибиторӗ (Roche) хушса гомогенизациленӗ. Белок виҫине бицинхонин кислоти анализӗпе (Thermo Fisher Scientific) усӑ курса палӑртнӑ. Унтан белоксене SDS-полиакриламид гель электрофорезӗпе уйӑрнӑ, унтан поливинилиденфторид мембрани ҫине (GE Healthcare) ҫыпӑҫтарнӑ. Ятарлӑ мар вырӑнсене пӳлӗр те пӗрремӗш антителапа (тӗплӗнрех S1 таблицӑна пӑхӑр) 5% сӗтпе TBST-ра (Трис-буферлӑ физиологиллӗ шыв), ҫуса тасатмалли тапхӑрсемпе тата TBST-ра иккӗмӗш антителапа инкубацилӗр. Пӗрремӗш антителапа +4°C температурӑра ҫӗр каҫа инкубацилемелле. Çуса тасатнӑ хыҫҫӑн иккӗмӗш антитела 2 сехет хушши пӳлӗм температуринче сӗрмелле. Кайран, ҫав блота анти-β-актин антителапа инкубацилесе, ҫав нагрузкӑнах ҫирӗплетнӗ. Химилюминесценцие куҫарса тата химилюминесценцие вӑйлатса тупса палӑртасси (GE Healthcare).
Кӗленче ҫине лартнӑ нейронсене 4% параформальдегидпа (ПФА)/ПФСпа палӑртнӑ вӑхӑтра пӳлӗм температуринче 10 минут хушши ҫирӗплетнӗ. Ҫивитти сийӗсене малтан 0,1% Triton X-100/PBS 5 минут хушши пӳлӗм температуринче, унтан блоклакан буферпа [3% ӗне сывлавӗн альбуминӗ (BSA)/PBS] ҫутатаҫҫӗ. Иккӗмӗш кунне ҫивиттисене блоклакан буферпа ҫуса тасатнӑ та тивӗҫлӗ флуорофорпа конъюгациленӗ иккӗмӗш антителапа пӳлӗм температуринче 2 сехет хушши инкубациленӗ; юлашкинчен, пробӑсене PBS-ра 4′,6-диамидино-2 -Фенилиндолпа (DAPI) лайӑх ҫуса тасатнӑ, унтан микроскоп слайчӗ ҫине Aqua-Poly/Mount ҫирӗплетнӗ.
Шӑшисене (арҫынсемпе хӗрарӑмсене) хырӑм ӑшне кетамин (130 мг/кг) тата ксилазин (10 мг/кг) янӑ та тир айне карпрофен анальгетикӗпе (5 мг/кг) янӑ, стереотактикӑллӑ инструмента (Kopf) лартнӑ, унта ӑшӑ ҫӑкӑр пур. Пуҫ шӑммине уҫса парӑр та шӑл дрелипе усӑ курса пуҫ мимин шӑммипе ҫыхӑннӑ пайне (лямбдӑран: хӳре 1,8, айккинчи 1, IV тата V лобулӑсене тивӗҫлӗ) сайралатма усӑ курӑр. Аялти юн тымарӗсене пӑсас мар тесе пуҫ шӑмми ӑшӗнче пӗчӗк шӑтӑк тума авӑнчӑк шприц йӗппипе усӑ курӑр. Унтан ҫӳхе кӗленче капилляра микрошӑтӑка майӗпен чиксе яраҫҫӗ (-1,3-ран пуҫласа -1 таран ҫирӗп ҫӑварӑн вар енче), 200-300 нл ААВ-а микроинжектора (Narishige) алӑпа ӗҫлекен шприцсемпе (Narishige) 20 минутран пуҫласа 10 минут хушшинче темиҫе хутчен те пӗчӗк пусӑмпа ямалла. Инфузи хыҫҫӑн капилляра тата 10 минут лартмалла, ҫапла майпа вирус пӗтӗмпех сарӑлтӑр. Капиллярсене кӑларнӑ хыҫҫӑн тирне питӗ лайӑх ҫӗлеҫҫӗ, ҫапла майпа суран шыҫӑвне чакараҫҫӗ тата чӗрчуна сыватма май параҫҫӗ. Операци хыҫҫӑн чӗрчунсене темиҫе кун хушши анальгетиксемпе (каспофен) сипленӗ, ҫав вӑхӑтра вӗсен ӳт-пӗвӗн лару-тӑрӑвне тимлӗн сӑнаса тӑнӑ, унтан вӗсене палӑртнӑ вӑхӑтра эвтанази тунӑ. Пур процедурӑна та Европӑри, наци тата институциллӗ йӗркесемпе килӗшӳллӗн пурнӑҫланӑ, вӗсене Германири Ҫурҫӗр Рейн-Вестфалири Umwelt тата Verbraucherschutz хулисенчи LandesamtfürNatur ҫирӗплетнӗ.
Чӗрчунсене кетаминпа (100 мг/кг) тата ксилазинпа (10 мг/кг) наркоз панӑ, чӗрене малтан 0,1 М ПФС, унтан ПФС-ра 4% ПФА перфузиленӗ. Ткань ҫурса илнӗ те 4% PFA/PBS ҫинче 4°C температурӑра ҫӗр каҫа ҫирӗплетнӗ. ПБС-ра ҫирӗплетнӗ пуҫ миминчен сагиталлӑ пайсене (50 мкм хулӑнӑш) хатӗрлеме вибрациллӗ ҫӗҫӗпе (Leica Microsystems GmbH, Вена, Австри) усӑ курнӑ. Урӑхла палӑртман пулсан, ирӗклӗн ишсе ҫӳрекен пайсене ҫӳлте ҫырса кӑтартнӑ пек (13) пӳлӗм температуринче тата пӑтратса сӑрланӑ. Кӗскен каласан, малтан илнӗ татӑксене 0,5% Triton X-100/PBS 15 минут хушши пӳлӗм температуринче пермеабилизациленӗ; хӑш-пӗр эпитопсемшӗн (Pcx тата Shmt2) 80°C (PH 9) температурӑра трис-ЭДТА буферӗнче ҫак утӑм вырӑнне 25 минут хушши татӑксене ӑшӑтмалла. Унтан татӑксене пӗрремӗш антителапа (S1 таблицӑна пӑхӑр) блокировщик буферӗнче (3% BSA/PBS) 4°C температурӑра ҫӗр каҫа пӑтратса инкубациленӗ. Тепӗр кунне секцисене блоклакан буферпа ҫуса тасатнӑ та тивӗҫлӗ флуорофорпа конъюгациленӗ иккӗмӗш антителапа пӳлӗм температуринче 2 сехет хушши инкубациленӗ; юлашкинчен, татӑксене PBS-ра лайӑх ҫуса тасатнӑ, DAPI-па хирӗҫле сӑрланӑ, унтан AquaPolymount-па микроскоп слайчӗ ҫинче ҫирӗплетнӗ.
Пробӑна ӳкерме лазерлӑ сканерлакан конфокаллӑ микроскоппа (TCS SP8-X е TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) усӑ курнӑ, ӑна шурӑ ҫутӑ лазерӗпе тата 405 диодлӑ ультрафиолет лазерӗпе тивӗҫтернӗ. Флюорофора хумхантарса тата сигнала гибридлӑ детекторпа (HyDs) пухса LAS-X программӑпа усӑ курса Nyquist дискретизацийӗпе килӗшӳллӗн ҫыпӑҫтарнӑ ӳкерчӗксене йӗркеллӗ режимра пухнӑ: йышлӑ мар панельсемшӗн вӑл питӗ динамика сигналӗсем (сӑмахран, соматика клеткисемпе дендритсенче) mtY FPD-сен Hybrid Detector-сен сылтӑм номерне ҫитиччен режим). Фона чакарма 0,3-6 нс хушшинчи шлюзсемпе усӑ кураҫҫӗ.
Сортланӑ клеткӑсене чӑн-чӑн вӑхӑтра ӳкерсе илни. Neurobasal-A хутӑшӗнче 1% B27 хушма тата 0,5 мМ GlutaMax хушса сортланӑ хыҫҫӑн клеткӑсене тӳрех поли-l-лизинпа сӑрланӑ кӗленче слайдсем ҫине (μ-Slide8 ну, Ibidi, каталог номерӗ 80826) лартнӑ, унтан ӑна 37°C температурӑра тата 12 сехет хушши клеткӑна 12% хушши тытнӑ халӑх пурӑн. Чӑн-чӑн вӑхӑтри ӳкерчӗксене Leica SP8 лазерлӑ сканерлакан конфокаллӑ микроскоппа тунӑ, унта шурӑ лазер, HyD, 63×[1,4 цифрӑллӑ диафрагмӑллӑ (NA)] ҫу объективӗ тата ӑшӑтмалли тапхӑр пур.
Шӑшие углекислӑ газпа хӑвӑрт наркоз панӑ та пуҫне касса татнӑ, пуҫ мимине пуҫ шӑмминчен хӑвӑрт кӑларнӑ та 200 мкм хулӑнӑш (13С маркировка экспериментӗ валли) е 275 мкм хулӑнӑш (икӗ фотон экспериментӗ валли) сагитальнӑй пайне касса ҫак материалсемпе тултарнӑ. Вальдорф, Германи) ҫак япаласемпе тулнӑ: 125 мМ пӑр пек сивӗ, углеродпа тулнӑ (95% O2 тата 5% CO2) сахал Ca2 + искусственнӑй пуҫ мимин шӗвекӗ (ACSF) NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буферӗ, NaCl, 2,5 мМ глюза 0,5 мМ CaCl2 тата 3,5 мМ MgCl2 (осмотика пусӑмӗ 310-330 ммоль). Илнӗ пуҫ мимин татӑкӗсене инкубаци умӗнхи камерӑна куҫармалла, унта ытларах Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буферӗ, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 10 мМ тата 20 мМ Ca. MgCl2) Вӑтам) рН 7,4 тата 310-ран пуҫласа 320 ммоль таран).
Сӑнӳкерчӗк тунӑ чухне татӑксене ятарлӑ сӑнӳкерчӗк пӳлӗмне куҫарнӑ, эксперимента вара 32°-ран пуҫласа 33°C таран пӗр пек температурӑра пӗр чарӑнмасӑр ACSF перфузийӗпе туса пынӑ. Ҫак ӗҫе тума нумай фотонлӑ лазерлӑ сканерлакан микроскоппа (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) усӑ курнӑ, ӑна Leica 25x объективлӑ линзӑпа (NA 0,95, шыв), Ti: Sapphire лазерпа (Chameleon Vision II, Coherent) усӑ курнӑ. FLIM модуль (ПикоХарп300, ПикоКвант).
Grx1-roGFP2 FLIM. ПН-сен цитоплазма редокс тӑрӑмӗн улшӑнӑвӗсене сагиталлӑ пуҫ мимин татӑкӗсенче икӗ фотонлӑ FLIM мелӗпе виҫнӗ, унта Grx1-roGFP2 биодатчик ПН-сене тӗлленӗ. PN сийӗнче ҫӗр ҫийӗнчен 50-80 мкм аяларах илмелли уй суйласа илеҫҫӗ, ҫапла майпа унта пурнӑҫлӑ PN (урӑхла каласан, дендритсем тӑрӑх шӑрҫа структури е нейронсен морфологи улшӑнӑвӗсем ҫукки) тата икӗ хут лайӑх roGFP2 сенсорӗ тата AAV кодлакан shRNA PCx е унӑн йӗркине тытса тӑракан AAV (mC-экспресси) пулнине тивӗҫтереҫҫӗ. Пӗр стеклӑ ӳкерчӗксене 2 хут цифрӑллӑ зумпа пухӑр [возбуждение хум тӑршшӗ: 890 нм; 512 нм 512 пиксель]. Тупса палӑртасси: шалти HyD, флуоресцеин изотиоцианат (FITC) фильтр ушкӑнӗ] тата 2-3 минут хушшинче ӳкерчӗк вӑтамланӑвӗпе усӑ курса ҫителӗклӗ фотонсем пухӑнаҫҫӗ (пурӗ 1000 фотон) кукӑр ҫыпӑҫтарма. Grx1-roGFP2 зондӑн сисӗмлӗхне тата FLIM условийӗсене тӗрӗслессине перфузи ACSF-не экзогенлӑ 10 мМ H2O2 хушнӑ чухне roGFP2 пурнӑҫ тӑршшӗн хакне сӑнаса тӑнипе (окислени ӳсӗмне ӳстерме, пурнӑҫ тӑршшӗне ӳстерме май парать), унтан 2 мМ дитиотит хушса (ҫакӑнпа ӗмӗр тӑршшӗ чакать пурнӑҫ тӑршшӗ чакни) (S8 ӳкерчӗк, D-ран пуҫласа G таран). FLIMfit 5.1.1 программӑпа усӑ курса илнӗ результатсене тишкермелле, пӗтӗм ӳкерчӗкӗн пӗр экспоненциаллӑ ванчӑк кукӑрне виҫнӗ IRF (инструмент хуравӗн функцийӗ) ҫине лартмалла, χ2 вара 1 патнелле пулать. Пӗр ПН пурнӑҫне шутласа кӑларма нерв кӗлетки таврашӗнчи маскӑна алӑпа ӳкернӗ, кашни маскӑн пурнӑҫ вӑхӑтне шутласа кӑларнӑ.
Митохондри потенциалӗн анализӗ. Ҫивӗч пайне 100 нМ ТМРМпа 30 минут хушши перфузиленӗ АКСФ ҫумне тӳрремӗнех хушса инкубациленӗ хыҫҫӑн ПН-сен митохондри потенциалӗн улшӑнӑвӗсене икӗ фотонлӑ микроскоппа виҫнӗ. ТМРМ ӳкерчӗкне зонда 920 нм ҫинче хумхантарса тата сигналсене пухма шалти HyD (тетраметилродамин изотиоцианат: 585/40 нм) усӑ курса тунӑ; пӗр пек хум тӑршшӗпе усӑ курса, анчах mtYFP ӳкерчӗкне тума урӑх шалти HyD (FITC :525/50) усӑ курса. Пӗр клетка шайӗнчи митохондри потенциалне хаклама ImageJ-ӑн Image Calculator плагинӗпе усӑ курӑр. Кӗскен каласан, плагин уравненийӗпе: signal = min (mtYFP, TMRM) тивӗҫлӗ каналӑн пӗр стеклӑ конфокаллӑ ӳкерчӗкӗнче Пуркинье Сомалире TMRM сигналне кӑтартакан митохондри регионне палӑртма усӑ кураҫҫӗ. Унтан пулса тухнӑ маскӑри пиксель лаптӑкне виҫеҫҫӗ, унтан mtYFP каналӑн тивӗҫлӗ пороглӑ пӗр стека ӳкерчӗкӗ ҫинче нормализацилеҫҫӗ, ҫапла майпа митохондри потенциалне кӑтартакан митохондри фракцине илеҫҫӗ.
Ӳкерчӗке Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) программӑпа ҫыхӑнтарнӑ. Плиткӑсен сканерланӑ ӳкерчӗкӗсем валли пӗр плиткӑн монтажне LAS-X программӑпа тивӗҫтернӗ автоматла ҫӗвӗ алгоритмӗпе усӑ курса тӑваҫҫӗ. Ӳкерчӗке калибровка тунӑ хыҫҫӑн ImageJ тата Adobe Photoshop программӑсемпе усӑ курса ӳкерчӗке малалла ӗҫлеме тата ҫутӑпа контраста пӗр пек йӗркелеме пулать. Графика хатӗрлеме Adobe Illustrator программӑпа усӑ курӑр.
мтДНК фокус анализӗ. Конфокаллӑ микроскоппа ДНК-на хирӗҫ антителасемпе паллӑ тунӑ пуҫ мимин пайӗсем ҫинче mtDNA аманӑвӗсен шутне виҫнӗ. Кашни тӗллевлӗ лаптӑка клетка кӗлеткипе кашни клеткӑн ядро ​​валли тунӑ, ҫав лаптӑка вара Multi Measure плагинпа (ImageJ программӑпа) шутласа кӑларнӑ. Цитоплазма лаптӑкне илме клетка ӳт-пӗвӗн лаптӑкӗнчен ядро ​​лаптӑкне кӑларса пӑрахмалла. Юлашкинчен, Analyze Particles плагинпа (ImageJ программӑллӑ хатӗр) порог ӳкерчӗкӗ ҫинчи mtDNA кӑтартакан цитоплазма ДНК точкисене автоматла майпа шутласа кӑларнӑ, илнӗ результатсене CTRL шӑшисен PN вӑтам кӑтартӑвӗпе нормализациленӗ. Результатсене кашни клеткӑра нуклеозидсен вӑтам шучӗпе кӑтартнӑ.
Белок экспрессийӗн анализӗ. ПН-ри белок экспрессине пӗр клетка шайӗнче хаклама ImageJ-ӑн Image Calculator плагинӗпе усӑ курӑр. Кӗскен каласан, тивӗҫлӗ каналӑн пӗр сийлӗ конфокаллӑ ӳкерчӗкӗнче, сигнал = мин (mtYFP, антитела) уравнени урлӑ, Пуркинӑри пӗр-пӗр антитела ҫине иммунореактивлӑх кӑтартакан митохондри регионне палӑртаҫҫӗ. Унтан ҫав маскӑри пиксель лаптӑкне виҫеҫҫӗ, унтан mtYFP каналӑн тивӗҫлӗ пороглӑ пӗр стека ӳкерчӗкӗ ҫинче нормализацилеҫҫӗ, ҫапла майпа кӑтартнӑ белокӑн митохондри фракцине илеҫҫӗ.
Пуркинже клеткисен ҫӑра тӑвӑрлӑхӗн анализӗ. ImageJ-ӑн Cell Counter плагинӗпе Пуркинье ҫӑра тӑвӑрлӑхне хаклама усӑ курнӑ, ӑна шутланӑ Пуркинье клеткисен шутне шутланӑ клеткӑсем йышӑннӑ пуҫ мимин ҫаврашки тӑршшӗ ҫине пайланӑ.
Тӗслӗх хатӗрлесси тата пухасси. Контроль ушкӑнӗнчи тата Mfn2cKO шӑшисен пуҫ мимисене 2% PFA/2,5% глутаральдегид 0,1 М фосфат буферӗнче (PB) ҫирӗплетнӗ, унтан корональнӑй пайсене цилиатсемпе (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австри) (50-ран пуҫласа 60 μm хулӑнӑш) хатӗрленӗ. тетраоксид тата 1,5% кали ферроцианидне пӳлӗм температуринче 1 сехет хушши лартмалла. Секцисене виҫӗ хутчен дистиллированнӑй шывпа ҫуса тасатнӑ, унтан 20 минут хушши 1% уранил ацетатлӑ 70% этанолпа сӑрланӑ. Унтан секцисене сортлӑ спиртпа типӗтнӗ те Durcupan ACM (Araldite casting resin M) эпоксидлӑ сӑмала (Electron Microscopy Sciences, каталог номерӗ 14040) ӑшне кремнийпе сӑрланӑ кӗленче слайдсем хушшине чикнӗ, юлашкинчен 60°C температурӑра 48 сехет хушши духовкӑра полимеризациленӗ. Пӗчӗк пуҫ мимин лаптӑкне суйласа илнӗ те 50 нм ҫӳхе татӑксене Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австри) ҫинче касса илнӗ те полистирол пленкӑпа сӑрланӑ 2×1 мм пӑхӑр ҫурӑк сетка ҫинче суйласа илнӗ. Секцисене 10 минут хушши H2O-ри 4% уранилацетат ирӗлчӗкӗпе сӑрланӑ, H2O-па темиҫе хутчен, унтан H2O-ри Рейнольдс тӑхлан цитрачӗпе 10 минут хушши ҫуса тасатнӑ, унтан H2O-па темиҫе хутчен ҫуса тасатнӑ. Микрографисене Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) трансмисси электрон микроскопӗпе TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 цифра камерипе (TVIPS GmbH, Gauting, USA) ӳкернӗ. Германи).
ААВпа чирленӗ шӑшисен пуҫ мимине уйӑрнӑ та 1 мм хулӑнӑш сагитальнӑй пай туса касса илнӗ, ҫавӑн пекех пуҫ мимине флуоресценци микроскопӗпе усӑ курса ААВпа чирленӗ ункӑна (урӑхла каласан, mCherry экспрессиленӗ) тупса палӑртнӑ. ААВ инъекцийӗ Пуркинье клеткисен сийӗн (т. е. пӗтӗм сийӗн тенӗ пекех) сахалтан та икӗ умлӑ-хыҫлӑ пуҫ мимин ҫаврашкисенче питӗ пысӑк трансдукци эффективлӑхне кӑтартакан экспериментсемпе кӑна усӑ кураҫҫӗ. ААВ-трансдукциленӗ петле ҫӗрлехи фиксаци хыҫҫӑн микродиссекциленӗ (0,1 М какао буферӗнче 4% ПФА тата 2,5% глутаральдегид) тата малалла ӗҫленӗ. EPON ҫыпӑҫтарма ҫирӗплетнӗ тканьне 0,1 М натрий какао буферӗпе (Applichem) ҫуса тасатнӑ, 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) 0,1 М натрий какао буферӗнче (Applichem) 4 сехет хушши инкубациленӗ, унтан 2 сехет хушши ҫуса тасатнӑ. 0,1 М кокамид буферӗпе 3 хутчен тепӗр хут тумалла. Унтан кашни этанол ирӗлчӗкне 4°C температурӑра 15 минут хушши инкубацилеме этанолӑн ҫӳлелле хӑпаракан ярӑмӗпе усӑ курнӑ, ҫапла майпа ткань шывсӑрланнӑ. Ткане пропилен оксичӗ ҫине куҫарнӑ та 4°C температурӑра EPON (Sigma-Aldrich) ҫинче ҫӗр каҫа инкубациленӗ. Ҫӗнӗ EPON-а пӳлӗм температуринче 2 сехет лартмалла, унтан 72 сехет хушши 62°C температурӑра лартмалла. Ультрамикротомпа (Leica Microsystems, UC6) тата алмаз ҫӗҫҫипе (Diatome, Biel, Switzerland) 70 нм ҫӳхе татӑксене касса илмелле, 37°C температурӑра 15 минут хушши 1,5% уранилацетатпа сӑрламалла, 4 минут хушши тӑхлан цитрат ирӗлчӗкӗпе сӑрламалла. Электрон микрографийӗсене JEM-2100 Plus трансмиссиллӗ электрон микроскопӗпе (JEOL) ӳкернӗ, ӑна Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) тата DigitalMicrograph программӑпа (Gatan) тивӗҫтернӗ. Анализ тума электрон микрографийӗсене 5000× е 10000× цифрӑллӑ зумпа илнӗ.
Митохондрисен морфологи анализӗ. Пур анализсем валли те уйрӑм митохондрисен контурӗсене ImageJ программӑпа усӑ курса цифра ӳкерчӗкӗсенче алӑпа палӑртнӑ. Тӗрлӗ морфологи кӑтартӑвӗсене тишкереҫҫӗ. Митохондри ҫӑра тӑвӑрлӑхне кашни клеткӑн пӗтӗмӗшле митохондри лаптӑкне цитоплазма лаптӑкӗ ҫине (цитоплазма лаптӑкӗ = клетка лаптӑкӗ-клетка ядро ​​лаптӑкӗ) × 100 пайланӑ чухне илнӗ процентпа кӑтартаҫҫӗ. Митохондрисен ista морфологине тишкернӗ те вӗсен тӗп формисене кура икӗ категорие («трубчатый» тата «блистер») уйӑрнӑ.
Аутофагосома/лизосома шучӗпе ҫӑра анализӗ. ImageJ программӑпа усӑ курса цифра ӳкерчӗкӗнчи кашни аутофагосомӑн/лизосомӑн контурӗсене алӑпа палӑртӑр. Автофагосома/лизосома лаптӑкне кашни клеткӑн пӗтӗмӗшле аутофагосома/лизосома структурин лаптӑкне цитоплазма лаптӑкӗ ҫине (цитоплазма лаптӑкӗ=клетка лаптӑкӗ-ядро лаптӑкӗ)×100 пайласан шутласа кӑларнӑ процентпа кӑтартаҫҫӗ. Аутофагосомӑсен/лизосомӑсен ҫӑра тӑвӑрлӑхне пӗтӗмӗшле шута пӗр клеткӑри аутофагосома/лизосома структурисен шучӗ ҫине пайласа шутлаҫҫӗ (цитоплазма лаптӑкӗ тӑрӑх) (цитоплазма лаптӑкӗ = клетка лаптӑкӗ-ядро лаптӑкӗ).
Ҫивӗч касмалли тата проба хатӗрлемелли маркировка. Глюкозӑна маркировка тума ыйтакан экспериментсем валли ҫивӗч пуҫ мимин татӑкӗсене инкубаци умӗнхи камерӑна куҫармалла, унта тулнӑ углерод (95% O2 тата 5% CO2), пысӑк Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буферӗ, 2,5 мМ NaCl, 2,5 мМ NaCl, 25 мМ NaCl) пур. d-глюкоза, 1,0 мМ CaCl 2 тата 2,0 мМ MgCl 2, рН 7,4 тата 310-320 мОсм таран йӗркеленӗ), унта глюкоза 13 C 6- Глюкоза улӑштарӑвӗ (Eurisotop, каталог номерӗ CLM-1396). Пируват маркировки кирлӗ экспериментсем валли ҫивӗч пуҫ мимин татӑкӗсене пысӑкрах Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буферӗ, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 10 мМ Ca.Cl тата 200 мМ Ad. MgCl2, рН 7,4 тата 310 таран 320мОсм таран лартмалла), унтан 1мМ 1-[1-13С]пируват (Eurisotop, каталог номерӗ CLM-1082) хушмалла. Секцисене 37°C температурӑра 90 минут хушши инкубацилемелле. Эксперимент вӗҫӗнче татӑксене 75 мМ аммиак карбонатлӑ шывлӑ ирӗлчӗкпе (рН 7,4) хӑвӑрт ҫуса тасатнӑ, унтан 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрилпа (ACN): метанол: шывра гомогенизациленӗ. Секцисене пӑр ҫинче 30 минут инкубациленӗ хыҫҫӑн пробӑсене 21 пин г 10 минут хушши 4°C центрифугӑланӑ, ҫутӑ супернатант SpeedVac концентраторта типӗтнӗ. Типӗтнӗ метаболит пеллетне анализ тӑвиччен -80°C температурӑра упранӑ.
С-паллӑ аминокислотӑн шӗвек хроматографийӗпе масс-спектрометри анализӗ. Шӗвек хроматографи-масс-спектрометри (LC-MS) анализӗ валли метаболит пеллетне 75 μl LC-MS сортлӑ шывра (Honeywell) ҫӗнӗрен суспендированнӑ. 21000 г 4°C температурӑра 5 минут центрифугӑланӑ хыҫҫӑн 20 мкл уҫӑлтарнӑ супернатант аминокислота юхӑмӗн анализӗ валли усӑ курнӑ, ытти экстракта вара ҫийӗнчех анион анализӗ валли усӑ курнӑ (аяларах пӑхӑр). Аминокислота анализне маларах ҫырса кӑтартнӑ бензоилхлорид дериватизацийӗн протоколӗпе усӑ курса тунӑ (55, 56). Пӗрремӗш тапхӑрта 20 мкл метаболит экстракчӗ ҫине 10 мкл 100 мМ натрий карбонатне (Sigma-Aldrich) хушнӑ, унтан 10 мкл 2% бензоилхлорид (Sigma-Aldrich) LC сортлӑ ACN ҫине хушнӑ. Пробӑна кӗске вӑхӑтлӑха ҫавӑрса илнӗ, унтан 21 пин г ҫинче 5 минут хушши 20°С температурӑра центрифугӑланӑ. Тасатнӑ супернатант 2 мл автопробник флаконне конус евӗрлӗ кӗленче вставкӑпа (200 мкл калӑпӑш) куҫармалла. Тӗслӗхсене Acquity iClass ультра-пысӑк ӗҫ тухӑҫлӑхлӑ ЖК системипе (Waters) усӑ курса анализланӑ, ӑна Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) пысӑк уйрӑмлӑхлӑ тӗрӗслӗхлӗ масс-спектрометрпа (Thermo Fisher Scientific) ҫыхӑнтарнӑ. Анализ тума 2 мкл деривативлӑ пробӑна 100×1,0 мм пысӑк ҫирӗплӗхлӗ кремний Т3 колонкине (Waters) 1,8 мкм пайӑркасем кӗртнӗ. Юхӑм хӑвӑртлӑхӗ 100 мкл/мин, буфер системи вара А буфертан (шывра 10 мМ аммиак формиатӗ тата 0,15% кӑткӑс кислоти) тата В буфертан (ACN) тӑрать. Градиент ҫакӑн пек: 0%B 0 минутра; 0%B. 0-15% B 0-0,1 минут хушшинче; 15-17% B 0,1-0,5 минут хушшинче; В 17-55% 0,5-14 минут хушшинче; В 55-70% 14-14,5 минутра; 14,5-70-100% B 18 минутра; 100% B 18-19 минутра; 100-0% B 19-19,1 минутра; 0% B 19,1-28 минутра (55, 56). QE-HF масс-спектрометр лайӑх ионизаци режимӗнче ӗҫлет, унӑн массӑллӑ диапазонӗ m/z (масса/заряд шайлашӑвӗ) 50-ран пуҫласа 750 таран. 60 000 уйӑрӑмлӑх, 3×106 ион мишеньӗ, ион вӑхӑчӗн чи пысӑк виҫи 1000 миллисекунд. Ӑшӑтнӑ электроспрей ионизацийӗн (ESI) ҫӑлкуҫӗ 3,5 кВ сирпӗтмелли напряженипе, 250°C капилляр температурипе, 60 AU (ирӗклӗ единици) ҫивитти сывлӑш юхӑмӗпе тата 20 AU пулӑшу сывлӑш юхӑмӗпе ӗҫлет. 250°C. S объектив 60 AU ҫине лартнӑ.
Анион хроматографийӗпе 13С паллӑланӑ органика кислотисен МС анализӗ. Ытти метаболит ҫӑраҫҫине (55 мкл) QE-HF масс-спектрометрпа (Thermo Fisher Scientific) ҫыхӑнтарнӑ Dionex ион хроматографи системипе (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) усӑ курса анализланӑ. Кӗскен каласан, 5 мкл метаболит экстракчӗ Dionex IonPac AS11-HC колонкӑна ВЭЖХ (2 мм×250 мм, пайӑрка калӑпӑшӗ 4 мкм, Thermo Fisher Scientific) 1. )он тултармалли шайлашуллӑ пуш-ин пайӑрка цикл режимӗнче янӑ. Dionex IonPac AG11-HC хурал колонки (2 мм х 50 мм, 4 мкм, Thermo Fisher Scientific). Колонка температурине 30°C тытса тӑраҫҫӗ, автопробиркӑна вара 6°C лартаҫҫӗ. Элюент генераторӗ урлӑ кали гидроксичӗн градиентне генерировать тума деионизациленӗ шывпа тивӗҫтернӗ кали гидроксичӗн картриджӗпе усӑ курӑр. Метаболитсене 380 мкл/мин юхӑм хӑвӑртлӑхӗпе уйӑрасси, ҫакӑн пек градиентпа усӑ курасси: 0-3 минут, 10 мМ КОН; 3-12 минут, 10-50 мМ KOH; 12-19 минут, 50-100 мМ KOH; 19-21 минут, 100 мМ KOH; 21-21,5 минут, 100-10 мМ KOH. Колонкӑна 10 мМ КОН айӗнче 8,5 минут хушши тепӗр хут шайлаштарнӑ.
Элюциленӗ метаболитсене колонка хыҫҫӑн 150 мкл/мин изопропанол хушмалли юхӑмпа пӗрлештереҫҫӗ те унтан отрицательнӑй ионизаци режимӗнче ӗҫлекен пысӑк уйрӑмлӑхлӑ масс-спектрометр ҫине яраҫҫӗ. MS 60 пин уйӑрӑмлӑхпа m/z 50-ран пуҫласа 750 таранхи массӑллӑ диапазона сӑнаса тӑрать. AGC 1×106 лартнӑ, чи пысӑк ион вӑхӑчӗ 100 мс пулнӑ. Ӑшӑтнӑ ESI ҫӑлкуҫӗ 3,5 кВ сирпӗтмелли напряженипе ӗҫленӗ. Ион ҫӑлкуҫӗн ытти настройкисем ҫакӑн пек: капилляр температури 275°C; оболочка газ юхӑмӗ, 60 АУ; пулӑшу газ юхӑмӗ, 20 AU 300°C, тата S линза 60 AU лартни.
13С паллӑланӑ метаболитсен даннӑйӗсене тишкерни. Изотопсен шайлашӑвӗн даннӑйӗсене тишкерме TraceFinder программипе (4.2 верси, Thermo Fisher Scientific) усӑ курӑр. Кашни хутӑшӑн пӗрпеклӗхне шанчӑклӑ эталонлӑ хутӑшпа тӗрӗсленӗ тата хӑй тӗллӗн анализланӑ. Изотопсене пуянлатмалли анализ тума кашни 13С изотопӑн (Mn) экстракциленӗ ион хроматограммин (XIC) лаптӑкне [M + H] + экстракциленӗ, кунта n — аминокислотӑсене анализлама усӑ куракан тӗллевлӗ хутӑшӑн углерод шучӗ е [ MH] + анионсене анализлама усӑ кураҫҫӗ. XIC-ӑн массӑллӑ тӗрӗслӗхӗ миллион пуҫне пилӗк пайран та сахалрах, RT-н тӗрӗслӗхӗ вара 0,05 минут. Пуянлатмалли анализа кашни тупнӑ изотоппа тивӗҫлӗ хутӑшӑн пур изотопӗсен суммине шутласа кӑлараҫҫӗ. Ҫак шайлашусене кашни изотопшӑн процентлӑ хаксем пек параҫҫӗ, результатсене вара молярлӑ процентлӑ пуянлӑх (МПП) пек кӑтартаҫҫӗ, ҫакна маларах ҫырса кӑтартнӑччӗ (42).
Шӑнтнӑ нейрон гранулине пӑр пек сивӗ 80% метанолпа (v/v) гомогенизациленӗ, ҫавӑрса илнӗ те -20°C температурӑра 30 минут хушши инкубациленӗ. Пробӑна тепӗр хут ҫавӑрмалла та +4°C температурӑра 30 минут хушши пӑтратмалла. Пробӑна 21 пин г 4°C температурӑра 5 минут хушши центрифугӑланӑ, унтан ҫав шыва пуҫтарнӑ та 25°C температурӑра SpeedVac концентраторпа типӗтнӗ. Ҫӳлте ҫырса кӑтартнӑ пек, сортланӑ клеткӑсен аминокислотисем ҫинче ЖК-МС анализӗ туса пӑхнӑ. TraceFinder (4.2 верси, Thermo Fisher Scientific) меслечӗпе усӑ курса кашни хутӑшӑн моноизотоплӑ массипе усӑ курса даннӑйсене тишкернӗ. Метаболит даннӑйӗсен квантильлӗ нормализацине preprocessCore программӑллӑ пакетпа (57) усӑ курса тунӑ.
Касса хатӗрлесси. Шӑшие хӑвӑрт углекислӑ газпа наркозланӑ та пуҫне касса татнӑ, пуҫ мимине хӑвӑрт пуҫ шӑмминчен кӑларнӑ, унтан пӑрпа тултарнӑ вибрациллӗ ҫӗҫӗпе (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) 300-375 мкм сагиталлӑ пайсене касса углерод тата сивӗ COd gas (25% O) Пӗчӗк Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буферӗ, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 1,0 мМ CaCl2 тата 6,0 мМ MgCl2 рН-а 70 мМ тата 30 мМ таран лартмалла). Илнӗ пуҫ мимин татӑкӗсене пысӑкрах Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буферӗ, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 4,0 мМ CaCl мМ тата 2,2 мМ рН/3 Mg) хушнӑ камерӑна куҫарӑр 7,4 тата 310-ран пуҫласа 320 мОсм таран). Ҫак татӑксене 20-30 минут хушши упрамалла, ҫапла вара вӗсене ҫырса илме пуҫличчен каялла тавӑрма пулать.
ҫыру. Пур ҫыру валли те ҫирӗплетнӗ ҫыру камерипе тата 20 хут шыва чикмелли объективпа (Scientifica) тивӗҫтернӗ микроскоп сценипе усӑ курнӑ. Пуркинье клеткисене (i) кӗлетке пысӑкӑшӗпе, (ii) пуҫ мимин анатомиллӗ вырӑнӗпе тата (iii) флуоресцентлӑ mtYFP репортер генӗн экспрессийӗпе палӑртнӑ. Вӗҫӗ 5-11 мегом таран хирӗҫ тӑракан патч-пипеткӑна боросиликатлӑ кӗленче капиллярпа (GB150-10, 0,86 мм×1,5 мм×100 мм, Science Products, Hofheim, Germany) тата горизонталь пипеткӑпа Instruments (P-1000, Sutter, Sutter, CA) туртса кӑлараҫҫӗ. Пур ҫырусене те ELC-03XS npi патч-кламп усилительпе (npi electronic GmbH, Tam, Германи) тунӑ, ӑна Signal программӑпа (6.0 верси, Cambridge Electronic, Cambridge, UK) тытса тӑнӑ. Эксперимента 12,5 кГц дискретизаци хӑвӑртлӑхӗпе ҫырса илнӗ. Сигнала 1,3 тата 10 кГц татӑлмалли ҫивӗчлӗхлӗ икӗ кӗске ҫуллӑ Бессель фильтрӗпе фильтрлаҫҫӗ. Мембранӑпа пипеткӑн емкостьне усилительпе усӑ курса компенсаци схемипе компенсацилеҫҫӗ. Пур экспериментсене те Orca-Flash 4.0 камерӑпа (Hamamatsu, Gerden, Germany) ертсе пынӑ, ӑна Hokawo программипе (2.8 верси, Hamamatsu, Gerden, Germany) тытса пынӑ.
Пӗтӗм клеткӑн йӗркеллӗ конфигурацийӗ тата анализӗ. Ҫырса илме пуҫличченех пипеткӑна шалти ирӗлчӗкпе тултармалла, унта ҫак япаласем пур: 4,0 мМ KCl, 2,0 мМ NaCl, 0,2 мМ EGTA, 135,0 мМ кали глюконатӗ, 10,0 мМ Hepes, 4,0 мМ АТФ (ММ), 05 мМ трифазофонат. (GTP) (Na) тата 10,0 мМ креатинин фосфатне рН 7,25 таран лартнӑ, осмотика пусӑмӗ 290 мОсм (сахароза) пулнӑ. Мембранӑна ҫурма 0 рА вӑй панӑ хыҫҫӑнах каннӑ мембрана потенциалне виҫнӗ. Кӗртнӗ хирӗҫ тӑрӑвне -40, -30, -20 тата -10 рА гиперполяризациленӗ токсемпе виҫеҫҫӗ. Напряжени хуравӗн пысӑкӑшне виҫсе илӗр те Ом саккунӗпе усӑ курса кӗртнӗ хирӗҫ тӑрӑва шутласа кӑларӑр. Хӑй тӗллӗн пулакан ӗҫ-хӗле 5 минут хушши напряжени хӗскӗчӗнче ҫырса пынӑ, sPSC-на Igor Pro (32 7.01 верси, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) программӑра ҫурма автоматлӑ палӑртмалли скриптпа усӑ курса палӑртнӑ тата виҫнӗ. IV кукӑрӗпе стационарлӑ тока батарейӑна тӗрлӗ потенциалпа (-110 мВ-ран пуҫласа) хӗстерсе тата 5 мВ тапхӑрпа напряженине ӳстерсе виҫеҫҫӗ. АП туса кӑларассине деполяризацилекен токпа тӗрӗсленӗ. Деполяризацилекен ток импульсне ӗҫлеттернӗ май ячейкӑна -70 мВ ҫинче хӗстермелле. Кашни ҫыру блокӗн утӑм калӑпӑшне уйрӑммӑн (10-ран пуҫласа 60 пА таран) йӗркелесе лартӑр. Чи пысӑк АП ҫивӗчлӗхне чи пысӑк АП ҫивӗчлӗхне кӑларса тӑратакан импульс шпикӗсене алӑпа шутласа шутласа кӑларӑр. АП чиккине деполяризаци импульсӗн иккӗмӗш производнӑйӗпе усӑ курса анализлаҫҫӗ, вӑл малтан пӗр е ытларах АП пуҫарать.
Шӑтӑклӑ патч конфигурацийӗ тата анализӗ. Стандартлӑ протоколсемпе усӑ курса шӑтӑклӑ патч ҫырса илӗр. АТФ- тата ГТФ-сӑр пипеткӑпа усӑ курӑр, унта ҫак ингредиентсем ҫук: 128 мМ глюконат К, 10 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 0,1 мМ EGTA тата 2 мМ MgCl2, рН 7,2 таран лартӑр (KOH усӑ курса). АТФ тата ГТФ клетка ӑшӗнчи ирӗлчӗкрен кӑларса пӑрахаҫҫӗ, ҫапла майпа клетка мембранин тӗрӗс мар витӗр тухассине сирсе яраҫҫӗ. Пластырь пипеткине амфотерицинлӑ шалти ирӗлчӗкпе (200-250 мкг/мл яхӑн; G4888, Sigma-Aldrich) тултараҫҫӗ, ҫапла майпа шӑтӑклӑ патч ҫинчен ҫырса кӑтартаҫҫӗ. Амфотерицина диметилсульфоксидра ирӗлтернӗ (юлашки концентраци: 0,1-0,3%; ДМСО; D8418, Sigma-Aldrich). Усӑ курнӑ ДМСО концентрацийӗ тӗпченӗ нейронсем ҫине пысӑк витӗм кӳмен. Перфораци вӑхӑтӗнче канал хирӗҫ тӑрӑвне (Ra) тӑтӑшах сӑнаса тӑнӑ, Ra тата AP амплитудине стабилизациленӗ хыҫҫӑн (20-40 минут) эксперимента пуҫланӑ. Хӑй тӗллӗн пулакан ӗҫ-хӗле 2-5 минут хушши напряженипе тата/е токпа виҫеҫҫӗ. Даннӑйсене анализлама Igor Pro (7.05.2 верси, WaveMetrics, АПШ), Excel (2010 верси, Microsoft Corporation, Redmond, АПШ) тата GraphPad Prism (8.1.2 верси, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) программӑсемпе усӑ курса тунӑ. Пӗрлешӳллӗ Штатсем). Хӑй тӗллӗн пулакан АП-сене тупса палӑртас тесе IgorPro компанийӗн NeuroMatic v3.0c плагинӗпе усӑ кураҫҫӗ. Кашни запись валли уйрӑммӑн тӳрлетнӗ панӑ порогпа усӑ курса АП-сене автоматла майпа палӑртӑр. Шпик интервалӗпе усӑ курса, шпик ҫивӗчлӗхне чи пысӑк самантлӑх ҫивӗчлӗхпе тата вӑтам ҫивӗч ҫивӗчлӗхпе палӑртӑр.
ПН изоляцийӗ. Унччен пичетленнӗ протоколпа килӗшӳллӗн, шӑши пуҫ миминчен палӑртнӑ тапхӑрта ПН-сене тасатнӑ (58). Кӗскен каласан, пуҫ мимине пӑр пек сивӗ диссоциаци хутлӑхӗнче [HBSS Ca2+ тата Mg2+сӑр, 20 мМ глюкоза, пенициллин (50 Е/мл) тата стрептомицин (0,05 мг/мл) хушса] уйӑрнӑ, унтан ҫав хутлӑха папаинпа [HBSS, HC-S, HC2+ хушнӑ (1 мг/мл), папаин (16 Е/мл) тата дезоксирибонуклеаза I (ДНаза I; 0,1 мг/мл)] 30°C температурӑра 30 минут хушши имҫамламалла. Малтан тканьсене HBSS хутӑшӗнче ҫӑмарта шӑрши (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) тата DNase (0,1 мг/мл) хушса пӳлӗм температуринче ҫуса тасатмалла, унтан 20 мМ глюкоза хушнӑ HBSS хутӑшӗнче HBSS хутӑшӗнче ҫемҫен авӑртмалла, стр. (0,05 мг/мл) тата ДНКаза (0,1 мг/мл) пӗр клеткӑна кӑлараҫҫӗ. Ҫак клеткӑсен суспензине 70 мкм клетка фильтрӗ витӗр сӑрӑхтарнӑ, унтан клеткӑсене центрифугӑпа (1110 ҫаврӑм/мин, 5 минут, 4°C) грануляциленӗ те сортировка хутӑшӗнче [HBSS, 20 мМ глюкоза, 20% ӗне ҫуратмалли ҫӑмарта хушнӑ) Сыворотка, пелин (50/5) тата стрипцина (0,05 мг/мл)]; пропидий йодичӗпе клеткӑсен пурнӑҫлӑхне хаклама тата клеткӑсен ҫӑра тӑвӑрлӑхне 1×106-ран пуҫласа 2×106 клетка/мл таран йӗркелеме. Юхӑм цитометрийӗ умӗн суспензие 50 мкм клетка фильтрӗ витӗр сӑрӑхтарнӑ.
Юхӑм цитометрӗ. Клеткӑсене 4°C температурӑра FACSAria III аппаратпа (BD Biosciences) тата FACSDiva программӑпа (BD Biosciences, 8.0.1 верси) усӑ курса уйӑрнӑ. Клетка суспензине 100 мкм форсункӑпа 20 psi пусӑмпа ~2800 событи/сек хӑвӑртлӑхпа сортланӑ. Йӑлана кӗнӗ шлюз критерийӗсем (клетка калӑпӑшӗ, бимодаллӑ уйӑрӑм тата сапалану характеристикисем) ытти клетка типӗсенчен PN-а тӗрӗс уйӑрса илме май паманран, шлюз стратегине mitoYFP+ ​​тата контроль mitoYFP − шӑшисенчи YFP хӑватлӑхне тата автофлуоресценцине тӳрремӗнех танлаштарни ҫинче никӗсленсе лартнӑ. YFP пробӑна 488 нм лазер линийӗпе ҫутатса хумхантарать, сигнала вара 530/30 нм диапазонлӑ фильтрпа тупаҫҫӗ. mitoYFP+ ​​шӑшисенче Rosa26-mitoYFP репортер генӗн шайлашуллӑ вӑйӗпе те нейрон кӗлеткипе аксон татӑкӗсене уйӑрма усӑ кураҫҫӗ. 7-ААД 561 нм сарӑ лазерпа хумханать те 675/20 нм диапазонлӑ фильтрпа вилӗ клеткӑсене кӑларса пӑрахма тупса палӑртать. Астроцитсене пӗр вӑхӑтрах уйӑрса илме клетка суспензине ACSA-2-APC сӑрӗпе сӑрланӑ, унтан пробӑна 640 нм лазер линийӗпе ҫутатнӑ, сигнала тупма 660/20 нм диапазонлӑ фильтрпа усӑ курнӑ.
Пухнӑ клеткӑсене центрифугӑпа (1110 ҫаврӑм/мин, 5 минут, 4°C) пеллетланӑ та усӑ куриччен -80°C температурӑра упранӑ. Mfn2cKO шӑшисене тата вӗсен ҫурисене пӗр кунрах классификацилеҫҫӗ, ҫапла майпа процедура улшӑнӑвне чакараҫҫӗ. FACS даннӑйӗсене кӑтартассине тата анализне FlowJo программӑпа (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, USA) усӑ курса тунӑ.
Ҫӳлте асӑннӑ пек (59), чӑн-чӑн вӑхӑтри ПЦРпа сортланӑ нейронсенчен ДНК уйӑрса илме усӑ кураҫҫӗ, ӑна каярахпа мтДНК виҫине палӑртаҫҫӗ. Линейность тата порог сисӗмлӗхне малтанах тӗрлӗ йышши клеткӑсем ҫинче qPCR туса тӗрӗсленӗ. Кӗскен каласан, 50 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1 мМ ЭДТА, 0,5% Твин 20 тата протеиназа К (200 нг/мл) лизис буферӗнче 300 ПН пуҫтармалла та 55°С температурӑра 120 минут хушши инкубацилемелле. Клеткӑсене малалла 95°C температурӑра 10 минут хушши инкубациленӗ, ҫапла майпа протеиназа К пӗтӗмпех инактивациленнӗ. mt-Nd1 валли ятарлӑ TaqMan зондпа (Thermo Fisher) усӑ курса mtDNA-на 7900HT Real-Time PCR системинче (Thermoherific Scientifics) ҫурма йышлӑ ПЦР мелӗпе виҫнӗ. Наука, каталог номерӗ Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Термо Фишер Сайентифик, каталог номерӗ AIVI3E8) тата 18S (Термо Фишер Сайентифик, каталог номерӗ Hs99999901_s1) генсем.
Протеом тӗслӗхне хатӗрлесси. Ирӗлчӗке 95°C температурӑра 10 минут хушши ӑшӑтса тата лизис буферӗнче [6 М гуанидин хлоридӗ, 10 мМ трис(2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлоридӗ, 10 мМ хлорацетамид тата 100 мМ трис-лиз шӑнтнӑ нейрон пеллетӗсенче] ультрасасӑпа ӗҫлеттерсе. Биоруптор (Диагенод) ҫинче 10 минут (30 ҫеккунт пульс / 30 ҫеккунт пауза тапхӑрӗ). Пробӑна 20 мМ трис-HCl (рН 8,0) 1:10 шайра ирӗлтернӗ, 300 нг трипсин ылтӑнӗпе (Promega) хутӑштарнӑ та 37°C температурӑра ҫӗр каҫа инкубациленӗ, ҫапла вара пӗтӗмпех ирӗлтернӗ. Иккӗмӗш кунне пробӑна 20 пин г 20 минут хушши центрифугӑланӑ. Ҫӳлти шыва 0,1% кӑткӑ кислотипе ирӗлтернӗ, ирӗлчӗке вара хӑйсем тунӑ StageTips препаратпа тӑварсӑрлатнӑ. Пробӑна SpeedVac инструментпа (Эппендорф концентраторӗ плюс 5305) 45°C температурӑра типӗтнӗ, унтан пептида 0,1% кӑпӑк кислотипе суспендированнӑ. Пур пробӑна та пӗр вӑхӑтрах пӗр ҫын хатӗрленӗ. Астроцитсен пробисене тишкерес тӗллевпе 4 мкг тӑварсӑр пептидсене тандемлӑ массӑллӑ тегпа (TMT10plex, каталог номерӗ 90110, Thermo Fisher Scientific) 1:20 шайлашуллӑ пептидпа TMT реагент шайлашӑвӗпе паллӑ тунӑ. ТМТ маркировки валли 0,8 мг ТМТ реагентне 70 мкл шывсӑр АСН-ра ҫӗнӗрен суспендированнӑ, типӗтнӗ пептида 9 мкл 0,1 М ТЭАБ (триэтиламмоний бикарбонат) ҫине ҫӗнӗрен йӗркеленӗ, ун ҫумне АСН-ри 7 мкл ТМТ реагентне хушнӑ. Концентраци 43,75% пулнӑ. минут хушши инкубациленӗ хыҫҫӑн реакцие 2 мкл 5% гидроксиламинпа сӳнтернӗ. Палӑртнӑ пептидсене пуҫтарнӑ, типӗтнӗ, 200 мкл 0,1% мӑйракаллӑ кислотӑра (FA) ҫӗнӗрен суспендированнӑ, икке пайланӑ, унтан хӑйсем тунӑ StageTips программӑпа усӑ курса тӑварсӑрлатнӑ. UltiMate 3000 ультра пысӑк ӗҫ тухӑҫлӑхлӑ шӗвек хроматографӗпе (UltiMate 3000 ультра пысӑк ӗҫ тухӑҫлӑхӗллӗ шӗвек хроматограф) усӑ курса икӗ ҫурринчен пӗрне 130Å1,7 мкм C18 пайӑркисемпе тултарнӑ 1 мм х 150 мм Acquity хроматографи колонки ҫинче фракциленӗ (Waters, каталог No SKU: 198566). Термо Фишер Сайентифик). Пептидсене 30 мкл/мин юхӑм хӑвӑртлӑхӗпе уйӑрӑр, 1%-ран пуҫласа 50% таран В буферне 85 минут хушши 96 минут хушши тапхӑрӑн-тапхӑрӑн градиентпа уйӑрӑр, 50%-ран пуҫласа 95% таран В буферне 3 минут хушши уйӑрӑр, унтан 95% В буферне 8 минут хушши уйӑрӑр; А буферӗ — 5% ACN тата 10 мМ аммиак бикарбонатӗ (ABC), В буферӗ — 80% ACN тата 10 мМ ABC. Кашни 3 минутра фракцисем пуҫтармалла та вӗсене икӗ ушкӑна (1 + 17, 2 + 18 тата ытти те) пӗрлештермелле те вакуумлӑ центрифугӑра типӗтмелле.
ЖК-МС/МС анализӗ. Масс-спектрометри валли пептидсене (r119.aq номер) 25 см, 75 мкм шалти диаметрлӑ PicoFrit аналитика колонки ҫинче (ҫӗнӗ объективлӑ линза, пай номерӗ PF7508250) уйӑрнӑ, ӑна 1,9 мкм ReproSil-Pur 120 C18-AQD хутӑшпа тивӗҫтернӗ (Maisch, ELC-D, Maisch-YAS). 1200 (Термо Фишер Сайентифик, Германи). Колонкӑна 50°C температурӑра тытнӑ. А тата В буферсем — шывра 0,1% кӑткӑс кислоти тата 80% ACN-ра 0,1% кӑткӑс кислоти. Пептидсене 65 минут хушши 6%-ран пуҫласа 31% таран В буфертан 200 нл/мин тапхӑрӑн-тапхӑрӑн градиентпа, 31%-ран пуҫласа 50% таран В буфертан 5 минут хушши уйӑрнӑ. Элюциленӗ пептидсене Orbitrap Fusion масс-спектрометрпа (Thermo Fisher Scientific) анализланӑ. Пептид прекурсорӗн m/z виҫине 120 пин уйӑрӑмлӑхпа 350-1500 м/з хушшинче тӑваҫҫӗ. 27% нормализациленӗ ҫапӑну энергийӗпе усӑ курса, пысӑк энергиллӗ С капкӑн диссоциацийӗн (HCD) ҫурӑлӑвӗ валли 2-6 зарядлӑ чи вӑйлӑ прекурсора суйласа илеҫҫӗ. Цикл вӑхӑчӗ 1 ҫеккунт лартнӑ. Пептид фрагменчӗн m/z хакне ион капкӑнӗнче чи пӗчӗк AGC мишеньпе 5×104 тата 86 мс чи пысӑк инъекци вӑхӑчӗпе усӑ курса виҫнӗ. Фрагментаци хыҫҫӑн прекурсора 45 ҫеккунт хушши динамика кӑларса пӑрахмалли список ҫине лартнӑ. ТМТ-па паллӑ тунӑ пептидсене 50 см, 75 мкм Acclaim PepMap колонки ҫинче (Thermo Fisher Scientific, каталог номерӗ 164942) уйӑрнӑ, миграци спектрӗсене вара Orbitrap Lumos Tribrid масс-спектрометр ҫинче (Thermo Fisher Scientific) анализланӑ, вӑл пысӑк симметриллӗ хумлӑ формӑллӑ (IMS) оборудовани (Thermo Fisher Scientific) −50 тата −70 В икӗ компенсаци напряженийӗпе ӗҫлет. Синхронизаци прекурсорӗ тӑрӑх суйласа илнӗ MS3 TMT отчет ион сигналне виҫме усӑ кураҫҫӗ. Пептидсене уйӑрассине EASY-nLC 1200 ҫинче 90% линейнӑй градиентлӑ элюципе усӑ курса, буфер концентрацийӗ 6%-ран пуҫласа 31% таран туса пынӑ; А буферӗ 0,1% FA пулнӑ, В буферӗ вара 0,1% FA тата 80% ACN пулнӑ. Аналитика колонки 50°C температурӑра ӗҫлет. FreeStyle (1.6 верси, Thermo Fisher Scientific) программӑпа усӑ курса малтанхи файла FAIMS компенсаци напряженийӗ тӑрӑх пайламалла.
Белоксене палӑртасси тата вӗсен шутне палӑртасси. Andromeda шырав системипе усӑ курса, малтанхи даннӑйсене MaxQuant 1.5.2.8 версийӗпе (https://maxquant.org/) тишкернӗ. Aequorea victoria-ран илнӗ Cre рекомбиназа тата YFP йӗркисемсӗр пуҫне, шӑши референс протеомӗн канон йӗркипе изоформӑллӑ йӗркине (Proteome ID UP000000589, 2017 ҫулхи май уйӑхӗнче UniProt-ран илнӗ) пептид фрагменчӗсен спектрӗсене шыранӑ. Метионин окислени тата белок N-вӗҫӗнчи ацетилировани улшӑнакан модификацисем пек лартнӑ; цистеин карбамоил метилированине ҫирӗп модификацисем пек лартнӑ. Пищеварительнӑй параметрсене «специфика» тата «трипсин/Р» ҫине лартнӑ. Белоксене палӑртма усӑ куракан пептидсемпе бритва пептидӗсен чи пӗчӗк шучӗ 1; хӑйне евӗрлӗ пептидсен чи пӗчӗк шучӗ 0. Пептид карттине танлаштармалли условисенче белок идентификацийӗн шайӗ 0,01 пулнӑ. «Иккӗмӗш пептид» опцие ӗҫлеттернӗ. Тӗрлӗ оригиналлӑ файлсем хушшинче ӑнӑҫлӑ идентификацисене куҫарма «match between runs» опципе усӑ курӑр. LFQ минимум шайлашӑвӗн 1-мӗш шутне ярлыксӑр виҫе (LFQ) (60) валли усӑ курӑр. LFQ интенсивлӑхне кашни вӑхӑтра сахалтан та пӗр генотип ушкӑнӗнче сахалтан та икӗ тӗрӗс хакшӑн фильтрлаҫҫӗ, ӑна вара 100 сарлакӑшлӑ нормаллӑ валеҫӳрен экстраполяцилеҫҫӗ. 0,3 тата 1,8 аялалла куҫӑр. LFQ результачӗсене тишкерме Perseus шутлав платформипе (https://maxquant.net/perseus/) тата R (https://r-project.org/) усӑ курӑр. Дифференциаллӑ экспресси анализӗ валли limma программӑллӑ пакетри икӗ енлӗ вӑтам t-тестпа усӑ курнӑ (61). Тӗпчев даннӑйӗсене ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally тата pheatmap меслечӗпе усӑ курса тишкереҫҫӗ. ТМТ никӗсӗ ҫинче тунӑ протеомика даннӑйӗсене MaxQuant 1.6.10.43 версийӗпе усӑ курса тишкернӗ. UniProt компанийӗн этем протеомикин базинче протеомикӑн чӗрӗ даннӑйӗсене шырӑр, ӑна 2018 ҫулхи сентябрьте илнӗ. Анализра производитель панӑ изотоп тасалӑхне тӳрлетмелли коэффициент пур. Дифференциаллӑ экспресси анализӗ валли R-ри лиммӑпа усӑ курӑр. Тӗп даннӑйсем, даннӑйсен базинче шырав результачӗсем, даннӑйсене тишкермелли ӗҫ юхӑмӗпе результатсем пурте ProteomeXchange альянсӗнче PRIDE партнер репозиторийӗ урлӑ PXD019690 даннӑйсен пуххин идентификаторӗпе упранаҫҫӗ.
Функциллӗ аннотацисем анализа пуянлатаҫҫӗ. эрнере даннӑйсен пуххин функциллӗ аннотаци терминӗсен пуянлӑхне палӑртма Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) хатӗрпе усӑ курнӑ (1-мӗш ӳкерчӗк). Кӗскен каласан, LC-MS/MS (тандемлӑ масс-спектрометри) даннӑйӗсене тишкерсе илнӗ йышлӑ белоксен списокне ҫакӑн пек фильтр критерийӗсемпе усӑ кураҫҫӗ: Mus musculus тӗсӗ тата фонӗ пек суйласа илеҫҫӗ, категори вара Benjamini 0,05 е унтан та пӗчӗкрех пуянлатма тӳрлетнӗ P хакне кӑтартать, ӑна пӗлтерӗшлӗ тесе шутлаҫҫӗ. Ку график валли кашни кластерти тӳрлетнӗ Р хакӗ тӑрӑх малти пилӗк ытлашши категорие кӑтартнӑ. Нумай t-тестпа усӑ курса, Benjamini, Krieger тата Yekutieli (Q = 5%) икӗ тапхӑрлӑ линейнӑй ӳстерӳ программипе усӑ курса, кашни категорире палӑртнӑ пӗлтерӗшлӗ кандидатсем ҫинче вӑхӑт хушшинчи белок экспрессийӗн анализне туса пыраҫҫӗ, кашни йӗркене уйрӑммӑн тишкереҫҫӗ. Пӗр пек SD йышӑнма кирлӗ мар.
Ҫак тӗпчев результачӗсене пичетленнӗ базӑсемпе танлаштарас тата 1-мӗш ӳкерчӗкри Венн диаграммине тума эпир йышлӑ белоксен списокне MitoCarta 2.0 аннотацийӗсемпе пӗрлештертӗмӗр (24). Диаграммӑна ӳкерме Венн диаграммине ӳкермелли онлайн-инструментпа (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) усӑ курӑр.
Протеомика анализӗ валли усӑ куракан статистика процедурисем ҫинчен тӗплӗнрех пӗлес тесен, тархасшӑн, Материалсемпе меслетсен тивӗҫлӗ пайне пӑхӑр. Ытти пур экспериментсем пирки те тӗплӗ информацие тивӗҫлӗ легендӑра тупма пулать. Урӑхла палӑртман пулсан, пур даннӑйсене те вӑтам ± SEM пек кӑтартнӑ, пур статистика анализӗсене те GraphPad Prism 8.1.2 программӑпа усӑ курса тунӑ.
Ҫак статья валли хушма материалсем илме http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
Ку вӑл — уҫӑ доступлӑ статья, ӑна Creative Commons Attribution-Non-Commercial License условийӗсемпе салатаҫҫӗ, вӑл кирек мӗнле хатӗрпе те усӑ курма, салатма тата ҫӗнӗрен кӑларма май парать, анчах та юлашки хут коммерциллӗ усӑ валли мар тата малтанхи ӗҫ тӗрӗс пулни ҫинчен калакан никӗс пулсан. Ссылка.
Асӑрхаттару: Эпир сире хӑвӑрӑн электронлӑ почта адресне ҫеҫ ыйтатпӑр, ҫапла вара эсир страницӑна сӗнекен ҫын эсир электронлӑ почтӑна курасшӑн пулнине тата вӑл спам маррине пӗлтӗр. Эпир нимӗнле электронлӑ почта адресӗсене те ҫырса илместпӗр.
Ку ыйтупа эсир хӑна пулнине тӗрӗслеме тата спам автоматла ярса пама чарма усӑ кураҫҫӗ.
Э. Мотори, И. Атанасов, С. М. В. Кочан, К. Фольц-Донахуэ, В. Сактивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Дж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Дисфункционаллӑ нейронсене протеомика анализӗ нейродегенерацие хирӗҫ кӗрешме ылмашӑну программисем активизациленнине кӑтартса панӑ.
Э. Мотори, И. Атанасов, С. М. В. Кочан, К. Фольц-Донахуэ, В. Сактивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Дж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Дисфункционаллӑ нейронсене протеомика анализӗ нейродегенерацие хирӗҫ кӗрешме ылмашӑну программисем активизациленнине кӑтартса панӑ.
©2020 Америка наукӑна аталантарас енӗпе ӗҫлекен ассоциацийӗ. пур правӑсем те сыхланса юлнӑ. AAAS — HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef тата COUNTER компанисен партнерӗ. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.