Хальхи вӑхӑтра†Хальхи адрес: OX11 0DE, Великобритани, Алмаз ҫурчӗ, Харвелл наука тата инноваци паркӗ, Диткот, Оксфордшир, Великобритани, Алмаз ҫутӑ ҫӑлкуҫӗ, электронлӑ биологи ӳкерчӗкӗсен центрӗ.
Реакци центрӗн ҫутӑ пухакан комплексӗ 1 (RC-LH1) — хӗрлӗ фототрофлӑ бактерисен тӗп фотосинтез компоненчӗ. Эпир Rhodopseudomonas palustris йышши RC-LH1 комплексӑн икӗ криоэлектрон микроскопи структурине кӗртрӗмӗр. RC-LH114-W комплексӑн 2,65-Å уйрӑмлӑхлӑ структури RC тавра 14 субединица LH1 петлисенчен тӑрать, вӗсене W белок пӳлет, ҫав вӑхӑтрах белок-W ҫук комплекс RC тавра пӗтӗмпех RC составлӑ. Хупнӑ 16 субединица LH1 петли. Ҫак структурӑсене танлаштарни RC-LH1 комплексӗнчи хинон динамикине, ҫав шутра RC QB вырӑнӗнче хинонпа ҫыхӑннӑ чухне унччен палӑртман конформаци улшӑнӑвӗсене, ҫавӑн пекех вӗсене RC-на куҫарма пулӑшакан пулӑшу хинон ҫыхӑнӑвӗн вырӑнӗсене ӑнланма май парать. W белокӑн хӑйне евӗрлӗ тытӑмӗ LH1 петлине хупма чӑрмантарать, ҫавна май хинон/хинолон ылмашӑвне хӑвӑртлатмалли канал туса хурать.
Фотосинтез панӑ энерги ҫӗр ҫинчи мӗнпур пурнӑҫа тенӗ пекех тытса тӑма пултарать, унӑн хӗвел биотехнологийӗ валли пысӑк потенциал пур. Пӗтӗм тӗнчери фотосинтез ӗҫне аталантарнӑ май, хӗрлӗ фототрофлӑ бактерисем те тӗрлӗ энерги мелӗсене тата ылмашӑну пултарулӑхне кӑтартаҫҫӗ. Вӗсем фотосинтезран пӑрӑнма тата тӗттӗмре гетеротрофлӑ бактерисем пулса ӳсме пултараҫҫӗ, азотпа углекислӑ газа ҫирӗплетме, водород туса кӑларма тата ароматлӑ хутӑшсене ҫӗмӗрме пултараҫҫӗ (1-3). Ҫак процессене энергипе тивӗҫтерес тесен ҫутта хӑвӑрт та тухӑҫлӑн хими энергине куҫармалла. Ҫак процесс ҫутта тытакан антенна комплексӗ ҫутта йышӑннӑ чухне тата тытнӑ энергие реакци центрне (RC) куҫарнӑ чухне пуҫланать, ҫапла вара заряд уйрӑлма пуҫлать (4 – 7). Кӗрен фототрофлӑ бактерисен фотосинтезӗн тӗп единици 2-мӗш тип RC-ран тӑрать, ӑна ҫутӑ пухакан 1-мӗш комплекс (LH1) хупӑрласа тӑрать, вӑл RC-LH1 тӗп комплексне йӗркелет. LH1 авӑнчӑк αβ гетеродимерсен массивӗнчен йӗркеленет, вӗсенчен кашниех икӗ бактери хлорофиллӗн (BChl) a молекулине тата пӗр-икӗ каротиноида (8-12) ҫыхӑнтарать. Чи ансат LH1 антенни 16 е 17 αβ гетеродимертан тӑрать, вӗсем RC (9-13) хупӑ циклпа хупӑрласа тӑраҫҫӗ, анчах ытти ядро ​​комплексӗсенче трансмембранӑллӑ пептидсем таврари LH1 тӑтӑшлӑхне пӑсаҫҫӗ, ҫапла вара RC тата цитохром bc комплексӗ хушшинчи хинол/хинон диффузине пулӑшаҫҫӗ (1111, 13). Кӗрен фототрофлӑ ӳсентӑран Rhodopseudomonas (Rps.) — фотосинтез пулӑшакан энергипе электрон куҫӑмне ӑнланма пултаракан модель организмӗ. Пӗрремӗш кристалл структури Rps. Palustris RC-LH1 комплексӗн моделӗ — RC, ӑна 15 гетеродимерлӑ LH1 петли хупӑрласа тӑрать, вӗсене «Протеин W» ятлӑ паллӑ мар белок пӳлет (14). Protein-W каярахпа RPA4402 тесе палӑртнӑ, вӑл 10,5 кДа виҫӗ прогнозланӑ трансмембранӑллӑ спираллӑ (TMH) характеристика паман белок (16). Эпир W белок кодлакан rpa4402 гена pufW ят пама сӗнетпӗр, ҫакӑ RC-L, M (pufL, pufM) тата LH1α, β (pufA, pufB) субединицисене кодлакан генсен номенклатурипе килӗшӳллӗ пултӑр. Тӗлӗнмелле, белок-W RC-LH1-ӑн 10% яхӑн кӑна пур, ҫакӑ Rps-а уҫса парать. palustris икӗ тӗрлӗ RC-LH1 комплекс туса кӑларать. Кунта эпир икӗ тӗп комплексӑн пысӑк уйрӑмлӑхлӑ крио-ЭМ (крио-ЭМ) структурисене пӗлтеретпӗр, вӗсенчен пӗри ​​W белокпа тата 14 αβ гетеродимерлӑ, тепри W белоксӑр тата хупӑ 16 гетеродимерлӑ LH1 петлеллӗ. Пирӗн структура Rps-ӑн RC-LH1 комплексне ӑнланса илме утӑм улшӑннине кӑтартать. palustris, мӗншӗн тесен эпир кашни вариантӑн пӗр евӗрлӗ популяцине тишкернӗ тата кашни пептида тата ҫыхӑннӑ пигментсене тата ҫыхӑннӑ липидсемпе хинонсене уҫҫӑн палӑртма ҫителӗклӗ уйрӑмлӑх пур. Ҫак структурӑсене танлаштарни ҫакна кӑтартать: халиччен ытти RC-LH1 комплексӗнче тупӑнман виҫӗ TMH белок-W хинон/хинолон ылмашӑвне хӑвӑртлатма хинон каналне туса хураҫҫӗ. Консервациленӗ липидсемпе хинон ҫыхӑнӑвӗн чылай вырӑнне тупса палӑртнӑ, эпир хинонпа РК пӗрлешнӗ хыҫҫӑн ҫӗнӗ конформаци улшӑнӑвне тупса палӑртрӑмӑр, вӑл кислородлӑ фототрофлӑ организмсен фотосистема II (PSII) РК валли юрӑхлӑ пулма пултарать. Пирӗн тупӑшусем хӗрлӗ фототрофлӑ бактерисен RC-LH1 тӗп комплексӗнчи хинон/хинолона ҫыхӑнтармалли тата улӑштармалли кинетикӑна ҫӗнӗлле ӑнланма май параҫҫӗ.
Rps-ра тупнӑ икӗ комплекса тӗплӗн тӗпчеме май парас тӗллевпе. palustris, эпир кашни RC-LH1 биохими мелӗпе уйӑратпӑр. Белок W-дефицитлӑ комплекса (малалла ΔpufW тесе ят панӑ) pufW ген ҫук штаммран тасатнӑ (16), ҫавӑнпа та пӗр RC-LH1 комплекс кӑна туса кӑларма пулать. W белоклӑ комплекса штамм туса кӑларать. Ҫак штаммӑн W белокне унӑн С-вӗҫӗнче 10 хут His тегпа улӑштарнӑ, ҫапла вара W белоклӑ комплекс металла иммобилизацилесе W белокӑн ытларах ҫитменлӗхӗпе витӗмлӗн пӗрлешме пултарать. Комплекс эффективлӑ уйрӑлса тӑрать (16) Аффинлӑ хроматографи (IMAC).
1-мӗш ӳкерчӗкре кӑтартнӑ пек, икӗ комплексра та виҫӗ подединица RC (RC-L, RC-M тата RC-H) пур, вӗсене LH1 антенна хупӑрласа тӑрать. Белок-W ҫук комплексӑн 2,80-А структуринче 16 αβ гетеродимер пур, вӗсем RC тавра пӗтӗмпех хупӑ LH1 петли туса хураҫҫӗ, ӑна малалла RC-LH116 комплексӗ теҫҫӗ. Белок-W-содержащий комплексӑн 2,65Å структуринче 14-гетеродимерлӑ LH1 пур, ӑна белок-W татса илет, ӑна малалла RC-LH114-W тесе ят параҫҫӗ.
(А тата В) Пӗрлешӗвӗн ҫиелти кӑтартӑвӗ. (C тата D) Ҫыхӑннӑ пигментсем, вӗсене ҫипсенче кӑтартнӑ. (E тата F) Цитоплазма ҫийӗнчен сӑнанӑ комплекссенче мультфильмсенче кӑтартнӑ пептидсемпе LH1 субединицисем пур, вӗсене белок-W хушӑкӗнчен сехет йӗппипе номерленӗ [Rba номерӗпе килӗшӳллӗн]. сфероидсен комплексӗ (13)]. LH1-α валли белок субединицин тӗсӗ сарӑ; LH1-β валли белок субединицин тӗсӗ кӑвак; белок-W валли белок хӗрлӗ; RC-H валли вӑл сиан; RC-L валли вӑл — Оранж; RC-M валли, пурпур. Кофакторсене ҫиппе кӑтартнӑ, симӗс тӗс BChl тата BPh a молекулисене, хӗрлӗ тӗс каротиноидсене, сарӑ тӗс UQ10 молекулӑсене кӑтартать. (G тата H) RC-LH114-W комплексӑн (G) тата RC-LH116 комплексӑн (H) эквивалентлӑ регионӗнчи белок-W хушшинчи пысӑклатнӑ ӳкерчӗк. Кофакторсем уҫлӑха тултарнӑ пек кӑтартнӑ, хелатлӑ хинон кӑвак тӗспе кӑтартнӑ. (G) ӳкерчӗкре белок-W хушшинчи уйрӑмлӑха кӑвак пунктирлӑ йӗрпе палӑртнӑ, LH116 ҫаврашки ҫинче хинон/хинолол диффузиленекен пӗчӗк шӑтӑксене вара (H) ӳкерчӗкре хура пунктирлӑ йӗрпе палӑртнӑ.
1-мӗш ӳкерчӗкре (А тата В) RC-на LH1αβ гетеродимерӗсен уҫӑ е хупӑ массивӗсемпе хупӑрласа тӑнине кӑтартнӑ, вӗсенчен кашниех икӗ BChl тата пӗр каротиноидпа ҫыхӑнать (1-мӗш ӳкерчӗк, С тата D). Унчченхи тӗпчевсем Rps LH1 комплекс пулнине кӑтартнӑ. Спирулина ксантинӗн биосинтез ҫулӗнче ҫак тӗссенче каротиноидсен хутӑш популяцийӗсем пур (17). Анчах та спиропирроксантин — доминантлӑ каротиноид, унӑн ҫӑра тӑвӑрлӑхӗ ҫителӗклӗ. Ҫавӑнпа та эпир LH1 ҫыхӑнӑвӗн пур вырӑнӗсенче те спироксантин моделлеме суйласа илтӗмӗр. Альфа тата бета полипептидсем — кӗске мембранӑллӑ тулаш пайӗллӗ пӗччен ТМГсем (1-мӗш ӳкерчӗк, А, В, Е тата F). С-вӗҫӗнче 17 юлашки ҫӑра тӑвӑрлӑхне асӑрхаман пулин те, альфа-полипептид икӗ комплексра та Met1-ран Ala46 таран ҫурӑлнӑ. β полипептид RC-LH116-ра Gly4-ран Tyr52 таран, RC-LH114-W-ра Ser5-ран Tyr52 таран чакнӑ. е 4 N-вӗҫӗнчи е 13 C-вӗҫӗнчи юлашкисен ҫӑра тӑвӑрлӑхӗ пулман (S1 ӳкерчӗк). Тискер штаммран хатӗрленӗ хутӑш RC-LH1 комплексӑн масс-спектрометри анализӗ ҫакна кӑтартнӑ: ҫук регион ҫак пептидсен гетерологлӑ ҫурӑлӑвӗн результачӗ пулнӑ (S1 тата S2 ӳкерчӗксем). α-Met1-ӑн N-вӗҫӗнчи формилированине те асӑрханӑ (f). Анализ ҫакна кӑтартнӑ: α-пептид fMet1-ран пуҫласа Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 таранхи юлашкисенчен тӑрать, β-пептид вара Ser2-ран пуҫласа Ala53 таранхи юлашкисенчен тӑрать, ку вара пӗчӗк температурӑллӑ ЭМ ҫӑра карттипе лайӑх килӗшсе тӑрать.
α-His29 тата β-His36 координацийӗ BChls-а куҫа-куҫӑн курма май парать; кашни αβ гетеродимер хӑйӗн кӳршисемпе пӗрле уҫӑ петле (RC-LH114-W) е хупӑ петле (RC-LH116) туса хурать. RC-LH114-W 877 нм диапазонӗпе танлаштарсан, RC-LH116 880 нм абсорбци хӗрлӗ куҫӑмӗ 3 нм (2А ӳкерчӗк). Анчах та ҫаврашка дихроизм спектрӗ пӗр пекех тенӗ пекех (2-мӗш ӳкерчӗк, В), ҫакӑ уҫӑ тата хупӑ петлесем хушшинче паллӑ уйрӑмлӑх пур пулин те, BChls-ӑн вырӑнти тавралӑхӗ питӗ пӗр пек пулнине кӑтартать. Абсорбци хӗрлӗ куҫӑмӗ хупӑ ҫаврашка ҫинчи ӑшӑ куҫӑмӗ чакнипе тата стабильлӗх ӳснипе (18, 19), хупӑ ҫаврашка пирки пигмент ҫыхӑнӑвӗ улшӑннипе (20, 21) е ҫак икӗ эффектӑн пӗрлешӗвӗпе (11) пулма пултарать.
(А) Ультрафиолет/курӑнакан/ҫывӑх инфрахӗрлӗ абсорбци спектрӗ, унӑн пикӗсене хӑйсен тивӗҫлӗ пигменчӗсемпе паллӑ тунӑ тата 775 нм ҫинчи BPh пикне нормализациленӗ. (B) 805 нм ҫинче BChl абсорбцийӗпе нормализациленӗ ҫаврашка дихроизм спектрӗ. (C тата D) RC-LH114-W комплексӑн (C) тата RC-LH116 комплексӑн (D) вӑхӑтпа палӑртнӑ абсорбци спектрӗсенчен суйласа илнӗ ΔA спектрӗсем. Лайӑхрах танлаштарма пур спектрсене те 0,2 пс чухне −A ∆A таран нормализацилеҫҫӗ. (Е) UQ2 тӗрлӗ концентрацийӗ пур чухне ҫутатнӑ хыҫҫӑн цитохром c2 окисленӗвӗн хӑвӑртлӑхӗ (чӗрӗ даннӑйсемшӗн S8 ӳкерчӗке пӑхӑр). (F) Пӗчӗк, вӑтам е пысӑк хӑватлӑ ҫутӑра (10, 30 е 300μMm-2 s-1) ӳстернӗ клеткӑсенче тасатнӑ комплексри W тата RC-L белок субединицисем тата уйӑрнӑ мембрана шайлашӑвӗ. Белок шайне SDS-полиакриламид гель электрофорезӗпе тата иммуноанализпа палӑртӑр (чӗрӗ даннӑйсемшӗн S9 ӳкерчӗке пӑхӑр). Тасатнӑ RC-LH114-W комплекспа танлаштарсан шайлашӑва палӑртӑр. Комплексӑн RC-L тата белок-W хушшинчи стехиометри шайлашӑвӗ 1:1.
RC-LH114-W-ӑн деформированнӑй αβ14 петлинчи 1-мӗш вырӑнти BChls (1-мӗш ӳкерчӗк, А, С тата Е) RC-LH116-ри эквивалентлӑ BChls-сенчен RC-LH116-ри эквивалентлӑ BChls-сенчен 6,8Å ҫывӑхрах (1-мӗш ӳкерчӗк, B, D, тата S тата S); анчах та икӗ комплексӑн вӑхӑтлӑх абсорбци кинетики RC-LH114-W тата RC-LH116 валли LH1-ран RC-на хумхану энергине куҫармалли вӑхӑт константисем 40 ±4 тата 44±3 пс пулнине кӑтартать (2-мӗш ӳкерчӗк). , C тата D, S4 ӳкерчӗк тата S2 таблица). Ҫавӑн пекех RC шайӗнче электронлӑ куҫарура та пысӑк уйрӑмлӑх ҫук (S5 ӳкерчӗк тата унпа ҫыхӑннӑ хушма текст). Эпир LH1 тата RC-P хушшинчи энерги куҫӑмӗн вӑхӑчӗн тачӑ ҫыхӑнӑвӗ икӗ LH1 петлинчи ытларах BChl-ӑн пӗр пек дистанцийӗпе, кӗтесӗпе тата потенциаллӑ энергийӗпе ҫыхӑннӑ тесе шутлатпӑр. LH1 энерги йӗркине чи пӗчӗк дистанцие ҫитме тӗпчесси субоптималлӑ вырӑнсенчен RC-на тӳрремӗнех энерги куҫарнинчен хӑвӑртрах мар пек туйӑнать. RC-LH114-W-ри уҫӑ цикллӑ LH1 петли структурӑллӑ анализ валли пӗчӗк температура условийӗсенче те пӗчӗк ӑшӑ хусканӑвӗ витӗр тухма пултарать, ҫавӑн пекех RC 1 вырӑнӗнчи βBChls пигментаци дистанцийӗнчен пӳлӗм температуринче αβ14 ункӑ конформацийӗ вӑрӑмрах пулать.
RC-LH116 комплексра 32 BChls тата 16 каротиноид пур, унӑн пӗтӗмӗшле вырнаҫӑвӗ вара Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) DB штамм (PDB) DB (IDC) (2917) штаммӗнчен илнӗ пекех. тата симӗс шыв курӑкӗсем (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Тӳрлетӳ хыҫҫӑн αβ гетеродимерсен вырӑнӗсенче пӗчӗк пӑрӑнӑҫсем ҫеҫ палӑрнӑ, уйрӑмах 1-5, 15 тата 16 (S6 ӳкерчӗк). Белок-W пурри LH1 структурине пысӑк витӗм кӳрет. Унӑн виҫӗ ТМХ кӗске петлесемпе ҫыхӑннӑ, N-вӗҫӗ комплексӑн люмен енче, С-вӗҫӗ цитоплазма енче (1А тата 3-мӗш ӳкерчӗксем, А-ран пуҫласа D таран). Protein-W ытларах чухне гидрофоблӑ (3-мӗш ӳкерчӗк, В), TMH2 тата TMH3 вара LH1αβ-14-па хутшӑнса трансмембранӑллӑ ҫиелти сий туса хураҫҫӗ (3-мӗш ӳкерчӗк, В тата Е-ран G таран). Интерфейс ытларах трансмембранӑллӑ регионти Phe, Leu тата Val юлашкисенчен тӑрать. Ҫак юлашкисем гидрофоблӑ аминокислотӑсемпе тата αβ-14 пигментсемпе купаланнӑ. Хӑш-пӗр полярлӑ юлашкисем те хутшӑнӑва пулӑшаҫҫӗ, ҫав шутра комплекслӑ шӑтӑк ҫийӗнчи W-Thr68 тата β-Trp42 хушшинчи водород ҫыхӑнӑвӗ (3-мӗш ӳкерчӗк, F тата G). Цитоплазма ҫийӗнче Gln34 αβ-14 каротиноидсен кето ушкӑнӗпе юнашар вырнаҫнӑ. Унсӑр пуҫне, n-додецил β-d-мальтозид (β-DDM) молекулине татса панӑ, унӑн гидрофоблӑ хӳри белок-W тата αβ-14 хушшинчи чикӗ патне ҫитичченех тӑсӑлнӑ, липид хӳри вара организмра вырнаҫма пултарать. Эпир ҫавӑн пекех W тата RCH белоксен С-вӗҫӗнчи уйрӑмлӑх регионӗсем питӗ ҫывӑх пулнине, анчах та ятарлӑ хутшӑнусем йӗркелес шайра маррине асӑрхарӑмӑр (1-мӗш ӳкерчӗк, А тата Е). Анчах та ҫак икӗ белокӑн татӑлман С-вӗҫӗнчи аминокислотӑсенче хутшӑнусем пулма пултараҫҫӗ, ҫакӑ вара RC-LH114-W комплекса пухнӑ чухне белок-W рекрутинг механизмне тивӗҫтерме пултарать.
(А) Протеин-W, мультфильм евӗрлӗ LH1αβ14 ҫыхӑнӑвӗ еннелле пӑхса тӑраканскер, электростатика потенциалӗн диаграммин пӗр пайӗнче (контур шайӗ 0,13 витӗр курӑнакан сӑрӑ ҫиелти сий) кӑтартнӑ ҫивӗч евӗрлӗ айккинчи сӑнчӑрлӑ (хӗрлӗ). (B) Протеин-W гидрофоблӑ тӗслӗ ҫиелти сийпе кӑтартнӑ. Полярлӑ тата зарядлӑ лаптӑксене сиан тӗспе, гидрофоблӑ лаптӑксене шурӑ тӗспе, вӑйлӑ гидрофоблӑ лаптӑксене сарӑрах тӗспе кӑтартнӑ. (C тата D) Мультфильмра кӑтартнӑ белок-W, унӑн ориентацийӗ (A) (C) ҫинчи пекех, 180° ҫаврӑннӑ (D). Йӗркери вырӑна кура уйӑрса илме пултаракан юлашкисем асамат кӗперӗ тӗслӗ схемӑна йышӑнаҫҫӗ, унта N-вӗҫӗ кӑвак, C-вӗҫӗ хӗрлӗ. (E) Protein-W (A) ҫинчи пекех курӑнать, тата белок-W:LH1 хушшинчи юлашкисене ҫыпӑҫтарнӑ паллӑсемлӗ ҫипсемпе кӑтартнӑ. (F) Протеин-W мультфильмри (E) тата LH1αβ14 еннелле 90° ҫаврӑнать, ҫавӑн пекех штрих ӳкерчӗкӗнчи интерфейс юлашкийӗсем еннелле ҫаврӑнать. Бета-полипептидран ҫакӑнса тӑракан юлашкисене паллӑ тунӑ. Кофактора 1-мӗш ӳкерчӗкри тӗспе килӗшсе тӑракан йӗр пек кӑтартнӑ, ҫӗмӗрӗлнӗ β-DDM-а сӑрӑпа, кислорода хӗрлӗ тӗспе кӑтартнӑ. (G) (F) ҫинчи ӳкерчӗке 180° ҫавӑрнӑ, унта паллӑ тунӑ альфа-полипептидӑн паллӑ юлашкийӗсем пур.
Protein-W αβ гетеродимера (1F ӳкерчӗкри 15-мӗшӗ) улӑштарать, ҫапла вара петле хупӑнмасть тата малтанхи виҫӗ αβ гетеродимера чалӑштарать. Пӗрремӗш αβ-1 гетеродимерӑн плёнка нормалӗпе танлаштарсан чи пысӑк тайӑлу кӗтесӗ 25°-ран пуҫласа 29° таран пулнине асӑрханӑ (1-мӗш ӳкерчӗк, А тата Е), вӑл αβ-1-ӑн 2°-ран пуҫласа 8° таран тайӑлӑвӗпе RC A ҫивӗч контраст-LH116 (1-мӗш ӳкерчӗк, В тата F) пулса тӑнӑ. Иккӗмӗшпе виҫҫӗмӗш гетеродимерсем 12°-ран пуҫласа 22° таран тата 5°-ран пуҫласа 10° таран чалӑшнӑ. RC стериллӗ чӑрмавне пула αβ-1 чалӑшӑвӗ αβ иккӗмӗш мӑшӑрне кӗртмест (вӑл 1F ӳкерчӗкри 16-мӗш αβ-па пӗр килет), ҫапла вара LH1 ункинче уҫӑмлӑ хушӑк пулса тӑрать (1-мӗш ӳкерчӗк, А тата Е). Икӗ αβ гетеродимер ҫуккипе, тӑватӑ BChl тата икӗ каротиноид ҫухалнипе пӗрлех, каротиноидсенчен пӗри ​​те пӑрӑннӑ αβ-1 субединиципе ҫыхӑнмасть, ҫавна пула LH114-W ункӑ пулса тӑрать, унта 13 каротиноид Vegetarian тата 28 BChls пур. αβ1-7 регионсенчи икӗ комплексӑн вырӑнти уйрӑмлӑх хаклавӗсем LH1 петлин ытти пайӗсенчен пӗчӗкрех, ҫакӑ RC QB вырӑнӗпе юнашар LH1 субединицин хӑйне евӗрлӗ пластичлӑхне кӑтартса пама пултарать (4-мӗш ӳкерчӗк).
RC-LH114-W (А тата В) тата RC-LH116 (С тата Д) ӳкерчӗкӗсене пӗр пек ҫӳлтен/айккинчен (А тата В) (А тата С) тата 1-мӗш ӳкерчӗкри шӑтӑк ҫийӗнчен кӑтартнӑ. (В тата Д). Тӗслӗ клавишӑсем сылтӑмра курӑнаҫҫӗ.
1:14 стехиометри шайлашӑвӗллӗ тепӗр характерлӑ ядро ​​комплексӗ — Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX димерӗ (13). Анчах та W тата PufX белоксен паллӑ гомологи ҫук, вӗсем хӑйсен LH1 структурисем ҫине пысӑк витӗм кӳреҫҫӗ. PufX — N-вӗҫлӗ цитоплазма доменлӑ пӗр ТМХ, вӑл RC-H субединицин (13) цитоплазма енӗпе Rps-па килӗшӳллӗ вырӑнта хутшӑнать. palustris LH116αβ-16. PufX RC-LH1 тата цитохром bcl комплексӗ хушшинче хинон/хинолон ылмашӑнӑвӗ валли канал туса хурать тата пур Rba-ра та пур. сфероидсен ядро ​​комплексӗ (13). Мономер-мономер хушшинчи ҫыхӑну Rba-ра пулсан та. Sphaeroides RC-LH1-PufX димерӗ RC-LH114-W-ра W белокӑн ҫыхӑну вырӑнӗнче вырнаҫнӑ, PufX тата белок-W ҫуратакан хушӑк вара эквивалентлӑ вырӑнта вырнаҫнӑ (S7A ӳкерчӗк). RC-LH114-W хушшинчи уйрӑмлӑх ҫавӑн пекех Pseudomonas rosea LH1 гипотезӑллӑ хинон каналӗпе (8) пӗр тан, вӑл W е PufX белокпа ҫыхӑнман пептидсенчен йӗркеленет (S7B ӳкерчӗк). Унсӑр пуҫне, Blc-ри хинон каналӗ те пур. Пӗр γ субединицине (7) кӑларса пӑрахса йӗркеленнӗ изумруд симӗс LH1 та ҫавӑн пекех вырӑнта вырнаҫнӑ (S7C ӳкерчӗк). Тӗрлӗ белоксем медиациленӗ пулин те, ҫак хинон/хинолол каналӗсем RC-LH1 комплексӗнче пӗр вырӑнта пулни конвергентлӑ эволюци тӗслӗхӗ пулса тӑрать, ҫакӑ W белок тунӑ хушӑк хинон каналӗ пек ӗҫлеме пултарнине кӑтартать.
LH114-W петлинчи хушӑк RC-LH114-W комплексӑн шалти уҫлӑхӗпе пысӑк мембрана хушшинче пӗр тӑтӑш мембрана регионне йӗркелеме май парать (1G ӳкерчӗк), анчах та икӗ домена белоксенчи пек белок шӑтӑкӗ урлӑ ҫыхӑнтармаҫҫӗ. RC-LH116 комплексӗ хупӑ Tch евӗрлӗ. Йӗп евӗрлӗ комплекс (22) (1Н ӳкерчӗк). Мембрана витӗр хинон диффузийӗ ансӑр белок каналӗ витӗр сарӑлнинчен хӑвӑртрах пулнӑран, уҫӑ LH114-W петли хупӑ LH116 петлинчен хӑвӑртрах RC ҫаврӑнӑшне тума май парать, хинон RC-на диффузийӗ ытларах чакма пултарать. W белок RC урлӑ хинонсен конверсине витӗм кӳнине тӗрӗслес тӗллевпе эпир убихинон 2 (UQ2) (ҫутҫанталӑк UQ10 аналогӗ кӗскерех изопрен хӳриллӗ) пӗр-пӗр концентрацийӗ ҫинче цитохром окислени анализне туса пӑхрӑмӑр (2Е ӳкерчӗк). Хелатлӑ хинон пурри курӑнакан Михаэлис константине тӗрӗс палӑртма чӑрмантарать пулин те (RC-LH114-W тата RC-LH116 0,2±0,1 мкМ тата 0,5±0,2 мкМ валли юрӑхлӑ), RC-LH114-W ( 4,6±0,0,2 мкМ) чи пысӑк хӑвӑртлӑхӗ ( 4,6± 0,6 ± 2-12 мкМ) танлашать. 28±5% RC-LH116-ран пысӑкрах (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Малтанах эпир белок-W тӗп комплексӑн 10% яхӑн пайӗнче пулнине шутларӑмӑр (16); кунта ҫутӑ сахал, вӑтам тата нумай ҫутӑ ӳсекен клеткӑсен йышӗ 15±0,6%, 11±1% тата 0,9±0,5 % (2F ӳкерчӗк). Масс-спектрометрин йышлӑ танлаштарӑвӗ ҫакна кӑтартнӑ: гистидин тегне хушни тискер йышши штаммсемпе танлаштарсан белок-W шайне чакарман (Р = 0,59), ҫавӑнпа та ҫак шайсем модификациленӗ белок-W артефакчӗ мар (S10 ӳкерчӗк). Анчах та RC-LH1 комплексра W белокӑн ҫак пӗчӗк йышӑнӑвӗ хӑш-пӗр RC-сене хӑвӑртлӑхпа ҫаврӑнма май парать, ҫавна май RC-LH116 комплексра хинон/хинолона ерипенрех ылмашӑнассине чакарать. Эпир ҫутӑ йышӑнӑвӗн пысӑк шайӗ юлашки вӑхӑтра транскриптомика кӑтартӑвӗсемпе килӗшсе тӑманнине асӑрхарӑмӑр, ҫакӑ pufW ген экспрессийӗ вӑйлӑ ҫутӑ айӗнче ӳснине кӑтартать (S11 ӳкерчӗк) (23). pufW транскрипцийӗпе RC-LH1 комплексне белок-W кӗртни хушшинчи уйрӑмлӑх пӑтраштарать, вӑл белокӑн комплекслӑ регуляцине кӑтартса пама пултарать.
RC-LH114-W-ра 6 кардиолипин (CDL), 7 фосфатидилхолин (POPC), 1 фосфатидилглицерин (POPG) тата 29 β-DDM молекула уйӑрнӑ та унта 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG тата 12 β-DDM моделленӗ. RC-LH116 (5-мӗш ӳкерчӗк, А тата В). Ҫак икӗ структурӑра CDL комплексӑн цитоплазма енче тенӗ пекех вырнаҫнӑ, POPC, POPG тата β-DDM вара ытларах ҫутӑ енче вырнаҫнӑ. RC-LH114-W комплексӑн αβ-1-ран пуҫласа αβ-6 таран икӗ липид тата детергент молекулине уйӑрнӑ (5А ӳкерчӗк), RC-LH116 эквивалентлӑ регионӗнче пиллӗкӗшне уйӑрнӑ (5В ӳкерчӗк). Комплексӑн тепӗр енче ытларах липидсем тупнӑ, тӗпрен илсен CDL, RC тата αβ-7 хушшинче пухӑннӑ αβ-13 таран (5-мӗш ӳкерчӗк, А тата В). Ытти структурӑллӑ уйӑрӑлнӑ липидсемпе детергентсем LH1 ҫаврашки тулашӗнче вырнаҫнӑ, лайӑх уйӑрӑлнӑ ацил сӑнчӑрӗсем LH1 субединицисем хушшинче тӑсӑлаҫҫӗ, вӗсене RC-LH114-W-ра β-DDM тесе малтанах палӑртнӑ, RC A хутӑшӗнче β-DDM тата PO-LH1616 хутӑшӗнче β-DDM тесе палӑртнӑ. Пирӗн структурӑри хелатлӑ липидсемпе детергентсен пӗр пек вырӑнӗсем вӗсем физиологи тӗлӗшӗнчен пӗлтерӗшлӗ ҫыхӑну вырӑнӗсем пулнине кӑтартаҫҫӗ (S12A ӳкерчӗк). Tch-ри эквивалентлӑ молекулӑсен вырӑнӗсем те лайӑх консистенциллӗ. Йӑваш та Трв. 970 штамм RC-LH1s (S12 ӳкерчӗк, B-ран пуҫласа E таран) (9, 12) тата липид пуҫ ушкӑнӗн водородпа ҫыхӑнакан юлашкисем йӗрке шайлашӑвӗнче самаях лайӑх упранса юлнине кӑтартнӑ (S13 ӳкерчӗк), ҫакӑ RC (24) ҫыхӑнакан Conservated CDL ҫак вырӑнсем RCH1-LH1 комплексӗнче сыхланса юлма пултарнине кӑтартать.
(А тата В) RC-LH114-W (А) тата RC-LH116 (В) пептидсене мультфильмсенче кӑтартнӑ, пигментсене вара 1-мӗш ӳкерчӗкри тӗс схемипе усӑ курса ҫипсемпе кӑтартнӑ. Липидсене хӗрлӗ тӗспе, ҫӑвакан ​​япаласене вара сӑрӑ тӗспе кӑтартнӑ. RC QA тата QB сайтсемпе ҫыхӑннӑ UQ сарӑ, уйрӑм UQ вара кӑвак. (С тата Д) (А) тата (В) пекех, липидсене кӑларса пӑрахнӑ. (E to G) RC-LH116-ран Q1(E), Q2(F) тата Q3(G) ӳкерчӗкӗсене пысӑклатнӑ, вӗсен айккинчи сӑнчӑрӗсем пӗр-пӗрин ҫине витӗм кӳреҫҫӗ. Водород ҫыхӑнӑвӗсене хура пунктирлӑ йӗрсемпе кӑтартнӑ.
RC-LH116-ра заряд уйӑрмалли процесра электрон куҫарма хутшӑнакан RC QA тата QB UQ иккӗшӗ те хӑйсен ҫыхӑну вырӑнӗсенче ҫӗрсе каяҫҫӗ. Анчах та RC-LH114-W-ра QB хинонне татса паман, ӑна аяларах тӗплӗнрех сӳтсе явӑпӑр. QA тата QB хинонсемсӗр пуҫне, икӗ хелатлӑ UQ молекула (RC тата LH1 ункӑсем хушшинче вырнаҫнӑ) RC-LH114-W структуринче вӗсен лайӑх уйӑрӑлнӑ пуҫ ушкӑнӗсем тӑрӑх (Q1 тата Q2-ре вырнаҫнӑ) уйӑраҫҫӗ. космос). 5С ӳкерчӗк). Q1-е икӗ изопрен единици уйӑрнӑ, ҫӑра картти вара Q2-н 10 изопрен хӳрине татса парать. RC-LH116 структуринче виҫӗ хелатлӑ UQ10 молекула (Q1-Q3, 5D ӳкерчӗк) уйӑрӑлнӑ, пур молекулӑсен те хӳре тӑрӑх уҫӑмлӑ ҫӑра (5-мӗш ӳкерчӗк, D-G таран). Икӗ структурӑра та Q1 тата Q2 хинон пуҫӗсен ушкӑнӗсен вырӑнӗсем питӗ лайӑх пӗр пек (S12F ӳкерчӗк), вӗсем RC-па кӑна хутшӑнаҫҫӗ. Q1 RC-LH114-W W хушӑкӗн алӑкӗ патӗнче вырнаҫнӑ (1G тата 5 ӳкерчӗксем, C, D тата E), Q2 вара QB ҫыхӑну вырӑнӗ ҫывӑхӗнче вырнаҫнӑ (5 ӳкерчӗк, C, D) тата F). Консервациленӗ L-Trp143 тата L-Trp269 юлашкисем Q1 тата Q2 патне питӗ ҫывӑх тата π-стакинг хутшӑнӑвӗсене тивӗҫтереҫҫӗ (5-мӗш ӳкерчӗк, E тата F тата S12 ӳкерчӗк). L-Gln88, 3,0 Å Q1 дистальнӑй кислородӗнчен, ҫирӗп водород ҫыхӑнӑвне тивӗҫтерет (5Е ӳкерчӗк); ҫак юлашки пур RC-сенче те сыхланса юлать, чи инҫетри ҫыхӑнусӑр пуҫне (S13 ӳкерчӗк). L-Ser91 ытти RC-сенче Thr вырӑнне консервативлӑ майпа йышӑнать (S13 ӳкерчӗк), Q1 метил кислородӗнчен 3,8 ангстром аяккарах тӑрать, вӑл вӑйсӑр водород ҫыхӑнӑвӗсене тивӗҫтерме пултарать (5E ӳкерчӗк). Q3 ятарлӑ хутшӑну ҫук пек курӑнать, анчах вӑл RC-M субединиципе LH1-α субединици 5-6 хушшинчи гидрофоблӑ регионта вырнаҫнӑ (5-мӗш ӳкерчӗк, D тата G). Q1, Q2 тата Q3 е ҫывӑхри хелатлӑ хинонсене те Tch-ра татса панӑ. Йӑваш, Трв. 970-мӗш штамм тата Blc. Ирис структури (9, 10, 12) RC-LH1 комплексра сыхланса юлнӑ пулӑшу хинон ҫыхӑнӑвӗн вырӑнне кӑтартать (S12G ӳкерчӗк). RC-LH116-ри пилӗк ҫӗрӗк UQ пысӑк ӗҫ тухӑҫлӑхлӑ шӗвек хроматографийӗпе (ВЭЖХ) палӑртнӑ кашни комплексӑн 5,8±0,7 шайӗпе лайӑх килӗшсе тӑраҫҫӗ, ҫав вӑхӑтрах RC-LH114-W-ри виҫӗ ҫӗрӗк UQ 6,2±0,3 (S14 ӳкерчӗк) шайӗнчен пӗчӗкрех. тытӑм.
Псевдосимметриллӗ L тата M полипептидсенче кашнинчех пилӗк TMH пур, вӗсем пӗр BChl димерне, икӗ BChl мономерне, икӗ бактериофаг (BPh) мономерне тата пӗр гем мар тимӗр тата пӗр е икӗ UQ10 молекулӑна пӗрлештерекен гетеродимер туса хураҫҫӗ. Вӗҫӗнчи кетон ушкӑнӗ ҫинче водород ҫыхӑнӑвӗсем пуррипе тата вӑл Rps-ра паллӑ пухӑннипе каротиноидсем М-субединицине кӗреҫҫӗ, ӑна цис-3,4-дегидроорходопин теҫҫӗ. Тӗс (25). RC-H-ӑн тулашри мембрана доменӗ мембрана ҫумне пӗр TMH ҫирӗплетсе тӑрать. Пӗтӗмӗшле RC структури тӑван тӗссен (сӑмахран, Rba) виҫӗ субединици RC евӗрлӗ. сфероидсем (PDB ID: 3I4D). BChl тата BPh макроциклӗсем, каротиноид тымарӗ тата гем мар тимӗр ҫак структурӑсен уйрӑмлӑх диапазонӗнче пӗр-пӗринпе ҫыхӑнса тӑраҫҫӗ, ҫавӑн пекех QA вырӑнӗнчи UQ10 пуҫ ушкӑнӗ тата RC-LH116 ҫинчи QB хинон (S15 ӳкерчӗк).
Икӗ RC структури пурри, вӗсен QB вырӑнӗн тӗрлӗ шайӗ пурри QB хинон ҫыхӑнӑвӗпе пӗрле пулакан пӗр пек конформаци улшӑнӑвӗсене тӗпчеме ҫӗнӗ май парать. RC-LH116 комплексӗнче QB хинон туллин ҫыхӑннӑ «проксималлӑ» вырӑнта вырнаҫнӑ (26), анчах RC-LH114-W уйрӑлӑвӗнче QB хинон ҫук. RC-LH114-W-ра QB хинон ҫук, ку тӗлӗнмелле, мӗншӗн тесен комплекс активлӑ, структурӑллӑ уйӑрӑлнӑ QB хинонлӑ RC-LH116 комплексран ытларах. Икӗ LH1 ҫаврашки ултӑ хинона яхӑн хелатлать пулин те, пиллӗкӗшӗ хупӑ RC-LH116 ункинче структурӑллӑ татӑлнӑ, уҫӑ RC-LH114-W ункинче вара виҫҫӗшӗ кӑна структурӑллӑ чикӗленнӗ. Ҫак ӳснӗ структурӑллӑ йӗркесӗрлӗх RC-LH114-W QB вырӑнӗсене хӑвӑртрах улӑштарнине, комплексри хинонӑсен кинетикине хӑвӑртрах тунине тата LH1 петли урлӑ каҫмалли шанӑҫлӑх ӳснине кӑтартса пама пултарать. Эпир RC-LH114-W RC QB сайтӗнче UQ ҫукки кӑткӑсрах та активлӑрах комплексӑн результачӗ пулма пултарать тесе шутлатпӑр, RC-LH114-W QB сайтӗ вара UQ ҫаврӑнӑшӗнче тӳрех шӑнса ларнӑ.
QB пулмасан, L-Phe217-па пӗрле UQ10 ҫыхӑнӑвӗпе килӗшсе тӑман вырӑна ҫаврӑнать, мӗншӗн тесен вӑл хӳре пӗрремӗш изопрен единиципе ҫӗр ҫинчи ҫапӑнӑва кӑларса тӑратать (6А ӳкерчӗк). Унсӑр пуҫне, паллӑ тӗп конформаци улшӑнӑвӗсем паллӑ, уйрӑмах спираль de (TMH D тата E хушшинчи петлери кӗске спираль), унта L-Phe217 QB ҫыхӑну кӗсйине куҫать тата L-Tyr223 ҫаврӑнӑшӗ (6А ӳкерчӗк) сайт (6-мӗш ӳкерчӗк, В). Хӑйӗн никӗсӗнче ҫаврӑнакан спираль, L-Ser209-ӑн Cα 0,33Å куҫать, L-Val221Cα вара 3,52Å куҫать. ТМХ D тата E-ра сӑнамалли улшӑнусем ҫук, вӗсем икӗ структурӑра та пӗр-пӗрин ҫине лартма пултараҫҫӗ (6А ӳкерчӗк). Эпир пӗлнӗ тӑрӑх, ку ҫутҫанталӑк RC-ри пӗрремӗш структура, вӑл QB сайтне хупать. Пӗтӗмӗшле (QB-ҫыхӑннӑ) структурӑпа танлаштарсан, хинона чакариччен ӑна хинона кӗртме конформаци улшӑнӑвӗ кирлине кӑтартать. L-Phe217 ҫаврӑнать те хинон пуҫ ушкӑнӗпе π-стекинг хутшӑнӑвӗ туса хурать, спираль вара тулалла куҫать, ҫакӑ L-Gly222 скелетне тата L-Tyr223 айккинчи сӑнчӑрне стабиллӗ водород ҫыхӑнӑвӗн структурипе водород ҫыхӑнӑвӗн сечӗ туса хума май парать (6-мӗш ӳкерчӗк, А тата С).
(А) Голограмма (L сӑнчӑр, сарӑ/М сӑнчӑр, пурпур) тата апо (кӑвак) структурӑллӑ пӗр-пӗринпе ҫыхӑнса тӑракан мультфильм, унта тӗп юлашкисене ҫип евӗрлӗ кӑтартнӑ. UQ10 сарӑ йӗрпе кӑтартнӑ. Пӑнчӑллӑ йӗр пӗтӗм структурӑра пулса кайнӑ водород ҫыхӑнӑвӗсене кӑтартать. (В тата С) Аполипопротеинӑн тата пӗтӗм ункӑ структурин ҫиелти ӳкерчӗкӗ, L-Phe217-ӑн айккинчи сӑнчӑрӗн кислородне кӑвакпа тата L-Tyr223-ӑн хӗрлӗ тӗспе палӑртнӑ. L субединици сарӑ-хӗрлӗ; М тата Н субединицисем тӗслӗ мар. (D тата E) Аполипопротеин (D) тата пӗтӗмӗшле (E) RC QB вырӑнӗсем [тӗсӗ (A) тӑрӑх] тата Thermophilus thermophilus PSII (симӗс, кӑвак пластик хинонпа; PDB ID: 3WU2) Тӳрлет (58).
Кӗтмен ҫӗртен, LH1сӑр QB-дефицитлӑ RC-сен темиҫе структури пур пулин те, ҫак тӗпчевре асӑрханӑ конформаци улшӑнӑвӗсем ҫинчен маларах пӗлтермен. Вӗсен шутне Blc-ран илнӗ QB чакмалли структура та кӗрет. виридис (PDB ID: 3PRC) (27), Тч. тепидум (PDB ID: 1EYS) (28) тата Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), вӗсем пурте хӑйсен пӗтӗмӗшле QB структурипе пӗр пекех тенӗ пекех. 3PRC-на тӗплӗн тӗрӗсленӗ май LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) ҫуса тасатмалли молекулӑсем QB позицине кӗнӗ ҫӗрте ҫыхӑннине, ҫакӑ вара хупӑ конформацие куҫма чӑрмантарма пултарнине палӑртнӑ. LDAO 1EYS е 1OGV-ра пӗр вырӑнта ҫӗрмест пулин те, ҫак RC-сене пӗр ҫӑвакан ​​япалапа хатӗрлеҫҫӗ, ҫавӑнпа та вӗсем пӗр пек эффект пама пултараҫҫӗ. Rba кристалл структури. Цитохром c2 (PDB ID: 1L9B) пӗрле кристаллизациленӗ Sphaeroides RC та хупӑ QB вырӑнӗ пур пек туйӑнать. Анчах та ку тӗслӗхре RC-M полипептидӑн N-вӗҫӗнчи пайӗ (Q спираль ҫинчи Tyr юлашкин H ҫыхӑнӑвӗ урлӑ QB ҫыхӑну вырӑнӗпе хутшӑнакан) ҫутҫанталӑкран тухнӑ конформацие йышӑнать, ҫавӑнпа та QB конформаци улшӑнӑвне малалла тӗпчемеҫҫӗ (30 ). Ҫакӑ лӑплантарать: эпир RC-LH114-W структуринче M полипептидӑн ҫакӑн пек деформацине курман, вӑл RC-LH116 RC-н N-вӗҫӗнчи регионӗпе пӗр пекех. Ҫавӑн пекех ҫакна та палӑртмалла: детергент ҫинче никӗсленнӗ LH1 антеннӑна пӗтернӗ хыҫҫӑн PDB-ри аполипопротеин RC-ӗсем татӑлнӑ, ҫакӑ вара RC-па таврари LH1 ҫаврашки хушшинчи хушӑкри шалти хинон пулӑсемпе липидсене пӗтернӗ (31, 32). RC функциллӗ юлать, мӗншӗн тесен вӑл пур кофакторсене те сыхласа хӑварать, ҫӗмӗрӗлме пултаракан QB хинонсӑр пуҫне, вӑл ҫирӗпрех мар тата хатӗрленӳ процесӗнче час-часах ҫухалать (33). Унсӑр пуҫне, LH1 тата ҫутҫанталӑк циклӗн липидӗсене RC-ран кӑларса пӑрахни функцисем ҫине витӗм кӳме пултарни паллӑ, сӑмахран, зарядпа уйрӑлнӑ P+QB-тӑрӑмӑн пурнӑҫ тӑршшӗ кӗскелни (31, 34, 35). Ҫавӑнпа та эпир ҫапла шутлатпӑр: RC тавра вырнаҫнӑ вырӑнти LH1 ункӑ пурри «хупӑ» QB вырӑнне тытса тӑма пултарать, ҫавна май QB ҫывӑхӗнчи вырӑнти тавралӑха сыхласа хӑварать.
Аполипопротеин (QB хинонсӑр) тата унӑн пӗтӗм структури QB вырӑнӗн ҫаврӑнӑшӗн икӗ сӑнӳкерчӗкне кӑна кӑтартаҫҫӗ пулин те, событисен ярӑмӗ мар, ҫыхӑнӑва гидрохинонпа ҫӗнӗрен ҫыхӑнассине сирсе яма май пуррине кӑтартакан паллӑсем пур. Аполипопротеинӑн QB вырӑнӗ ҫывӑхӗнчи хинололпа хинон хушшинчи хутшӑну тӗрлӗрен пулма пултарать, ҫакӑ вара ӑна RC сирсе яма май парать. Конформаци улшӑнӑвӗсем хинонсен ҫыхӑнӑвӗнче тата чакассинче пысӑк вырӑн йышӑннине тахҫанах сӗннӗ. Шӑнтнӑ RC-сен тӗттӗм адаптаци хыҫҫӑн хинонсене чакарма пултарасси пӑсӑлать (36); Рентген кристаллографийӗ ҫак сиен QB хинонӗсем активлӑ проксималлӑ вырӑнтан 4,5 Å яхӑн «дистальнӑй» конформацире тыткӑна лекнипе пулнине кӑтартать (26) , 37). Эпир ҫак дистальнӑй ҫыхӑну конформацийӗ аполипопротеинпа тулли ҫаврашка структури хушшинчи вӑтам тӑрӑмӑн ӳкерчӗкӗ пулнине шута илетпӗр, вӑл хинонпа малтанхи хутшӑну тата QB сайт уҫӑлни хыҫҫӑн пулать.
Хӑш-пӗр фототрофлӑ бактерисемпе цианобактерисен, шыв курӑкӗсен тата ӳсентӑрансен PSII комплексӗнче тӗл пулакан II тип RC структурӑллӑ тата функциллӗ упранать (38). 6-мӗш ӳкерчӗкре кӑтартнӑ структура шайлашӑвӗ (D тата E) PSII RC-семпе бактери RC комплексӗн QB вырӑнӗ хушшинчи пӗрпеклӗхе палӑртать. Ҫак танлаштару тахҫантанпах хинон ҫыхӑнӑвӗпе редукцийӗн тачӑ ҫыхӑннӑ тытӑмӗсене тӗпчес ӗҫре модель пулса тӑнӑ. Унчченхи публикацисенче конформаци улшӑнӑвӗсем хинонсен PSII чакнипе пӗрле пулнине палӑртнӑ (39, 40). Ҫавӑнпа та, RC эволюциллӗ упранса юлнине шута илсен, ҫак унччен асӑрхаман ҫыхӑну механизмӗ кислородлӑ фототрофлӑ ӳсентӑрансенчи PSII RC QB вырӑнӗнче те усӑ курма пултарать.
Rps ΔpufW (маркировка туман pufW делецийӗ) тата PufW-His (C-терминал 10x His-теглӑ белок-W ҫутҫанталӑк pufW локусӗнчен экспрессиленӗ) штаммсем. palustris CGA009 пирӗн малтанхи ӗҫре (16) ҫырса кӑтартнӑ. Ҫак штаммсене тата изогенлӑ тискер йышши ашшӗ-амӑшне морозильникрен PYE (кашни 5 г литр -1) (-80 °C температурӑра LB-ра упраннӑ, унта 50% ( w/v) глицерин) белок, дрожжевой экстракт тата сукцинат) агар [1,5%/v) пластинка ҫине сахал йышлӑ клеткӑсене йӗрлесе кӑларнӑ. Плита анаэроблӑ условисенче пӳлӗм температуринче тӗттӗмре ҫӗр каҫа инкубациленӗ, унтан OSRAM 116-Вт галоген лампочкисемпе (RS Components, UK) панӑ шурӑ ҫутӑпа (~50 μmolm-2 s-1) 3-5 кун хушши пӗр колони тухиччен ҫутатнӑ. Пӗр колонипе 10 мл М22+ хутлӑха (41) 0,1% (в/т) казаминокислотӑсемпе (малалла М22 тесе ят панӑ) хушса инокуляциленӗ. Культурӑна кислород сахал условисенче тӗттӗмре 34°C температурӑра 180 ҫаврӑм/мин хӑвӑртлӑхпа 48 сехет хушши силлесе ӳстернӗ, унтан ҫав условисенчех 24 сехет хушши 70 мл культурӑна инокуляциленӗ. мл калӑпӑшлӑ ҫурма аэроблӑ культурӑпа 30 мл универсаллӑ винтлӑ витӗр курӑнакан кӗленче кӗленчене 30 мл М22 хутӑшне инокуляцилеҫҫӗ те 48 сехет хушши стерильлӗ магнит вӑйӗпе пӑтратса (~50 мкмольм-2 с-1) ҫутатаҫҫӗ. Унтан 30 мл культурӑна ҫав условисенчех 1 литр яхӑн культурӑпа инокуляциленӗ, унтан 72 сехет хушши ~200 мкмольм-2 с-1 ҫутӑпа ҫутатнӑ 9 литр яхӑн культурӑна инокуляциленӗ. Клеткӑсене 7132 RCF температурӑра 30 минут хушши центрифугӑласа пуҫтарнӑ, ~10 мл 20 мМ tris-HCl (рН 8,0) шывра ҫӗнӗрен суспендированнӑ, кирлӗ пуличчен -20°C температурӑра упранӑ.
Ирӗлнӗ хыҫҫӑн ҫӗнӗрен суспендированнӑй клеткӑсене дезоксирибонуклеаза I (Merck, UK), лизоцим (Merck, UK) тата Roche голофермент протеаза ингибиторӗн икӗ таблетки (Merck, UK) кристалӗсене хушмалла. 20,000 psi француз пусӑмӗн ячейкинче (Aminco, АПШ) ячейкӑсене 8-12 хутчен пӑснӑ. Ҫурӑлман клеткӑсене тата ирӗлмен ҫӳп-ҫапа 18500 RCF температурӑра 4°C температурӑра 15 минут центрифугӑласа кӑларнӑ хыҫҫӑн мембранӑна пигментлӑ лизатран 113 пин RCF температурӑра 2 сехет хушши 43 000°C температурӑра центрифугӑласа ҫуса тасатнӑ. Ирӗлекен фракцие кӑларса пӑрахӑр та тӗслӗ мембранӑна 100-200 мл 20 мМ трис-HCl (рН 8,0) ҫине ҫӗнӗрен лартӑр та курӑнакан агрегатсем пуличчен гомогенизацилӗр. Ҫакӑнса тӑракан мембранӑна 20 мМ tris-HCl (рН 8,0) (Anatrace, USA) 2% (w/v) β-DDM хушса 1 сехет хушши тӗттӗмре 4°C температурӑра ҫемҫен пӑтратса инкубациленӗ. Унтан 70°C температурӑра 150 пин RCF 4°C температурӑра 1 сехет хушши ирӗлтерме центрифугӑламалла, юлашки ирӗлмен япаласене кӑлармалла.
ΔpufW штаммӑн ирӗлтерекен мембранине 50 мл DEAE Sepharose ион ылмаштармалли колонкӑна виҫӗ колонка калӑпӑшӗпе (CV) ҫыхӑну буферӗпе [20 мМ tris-HCl (рН 8,0) 0,03% (w / v) β-DDM] хушнӑ. Колонкӑна икӗ CV ҫыхӑну буферӗпе ҫуса тасатмалла, унтан колонкӑна 50 мМ NaCl хушнӑ икӗ ҫыхӑну буферӗпе ҫуса тасатмалла. RC-LH116 комплексне 150-300 мМ NaCl (ҫыхӑну буферӗнче) 1,75 CV ҫинче линейнӑй градиентпа элюциленӗ, ытти ҫыхӑну комплексне 0,5 CV ҫинче 300 мМ NaCl хушнӑ ҫыхӑну буферӗпе элюциленӗ. 250 тата 1000 нм хушшинчи абсорбци спектрне пухмалла, 880-280 нм хушшинче 1-рен пысӑкрах абсорбциллӗ фракцие (A880/A280) тытмалла, ӑна ҫыхӑну буферӗнче икӗ хутчен ирӗлтермелле те ҫавӑн пекех каллех DEAE колонки ҫинче усӑ курмалла. А880/А280 шайлашӑвӗсем 1,7-рен пысӑкрах тата А880/А805 шайлашӑвӗсем 3,0-ран пысӑкрах пулнӑ фракцисене ирӗлтермелле, ион улӑштарӑвӗн виҫҫӗмӗш турне тумалла, ҫавӑн пекех А880/А280 шайлашӑвӗсем 2,2-рен пысӑкрах тата А880/А805 шайлашӑвӗсем 3,0-ран пысӑкрах пулнӑ фракцисене сыхласа хӑвармалла. Пӗр пайӗпе тасатнӑ комплекса Amicon 100,000 молекулярлӑ йывӑрӑшлӑ (MWCO) центробежнӑй фильтрта (Merck, UK) ~2 мл таран концентратланӑ, унтан Superdex 200 16/600 виҫеллӗ эксклюзи колонки ҫине (GE Healthcare, US) 200 мМ NaCl тата ҫав буфертах 15 мл буферта ҫунтарнӑ. CV. Пысӑкӑшне кӑларса пӑрахмалли фракцин абсорбци спектрӗсене пухӑр та абсорбци спектрӗсене A880/A280 шайлашӑвӗсемпе 2,4 тата A880/A805 шайлашӑвӗсемпе 5,8-ран пуҫласа 100 A880 таран пухӑр та вӗсене ҫийӗнчех крио-ТЭМ сетка хатӗрлеме е упрама усӑ курӑр.
PufW-His штаммӗнчи ирӗлтерекен мембранӑна 20 мл HisPrep FF Ni-NTA Sepharose колонки ҫине (20 мМ tris-HCl (рН 8,0) 200 мМ NaCl тата 0,03% (w/w)) IMAC буферӗнче (GE Healthcare) хунӑ. v) β-DDM]. Колонкӑна пилӗк CV IMAC буферпа ҫуса тасатнӑ, унтан 10 мМ гистидинлӑ пилӗк CV IMAC буферпа ҫуса тасатнӑ. Тӗп комплекса колонкӑран 100 мМ гистидинлӑ пилӗк IMAC буферпа элюциленӗ. RC-LH114-W комплекслӑ фракцие Amicon 100,000 MWCO фильтрпа (Merck, UK) тивӗҫтернӗ пӑтратнӑ цистернӑра ~10 мл таран концентратлаҫҫӗ, 20 хутчен ҫыхӑнтаракан буферпа ирӗлтереҫҫӗ, унтан 25 мл таран хушаҫҫӗ. Колонкӑна тӑватӑ CV ҫыхӑну буферӗпе ҫуса тасатмалла, унтан комплекса сакӑр CV ҫинче 0-ран пуҫласа 100 мМ NaCl (ҫыхӑну буферӗнче) линейнӑй градиентпа элюцилемелле, ытти тӑватӑ CV вара 100 мМ ҫыхӑну буферӗ пур. A880/A805 шайлашӑвӗ 4,6 фракцирен пысӑкрах пулнине Amicon 100,000 MWCO центробежнӑй фильтрта ~2 мл таран концентратланӑ, унтан малтанах 1,5 CV IMAC тултарнӑ. Пысӑкӑшӗпе кӑларса пӑрахнӑ фракцисен абсорбци спектрӗсене пухӑр та абсорбци спектрӗсене A880/A280 шайлашӑвӗсемпе 2,1 тата A880/A805 шайлашӑвӗсемпе 4,6-ран пуҫласа 100 A880 таран пухӑр, вӗсене ҫийӗнчех шӑнтнӑ ТЭМ сетка хатӗрлеме усӑ кураҫҫӗ е -80°C кирлӗ таран упраҫҫӗ.
Пӗчӗк температурӑллӑ ТЭМ сеткисене хатӗрлеме Leica EM GP иммерси морозильникӗпе усӑ курнӑ. Комплекса IMAC буферӗнче 50 A880 таран ирӗлтернӗ, унтан 5 мкл ҫӗнӗрен ҫутатакан QUANTIFOIL 1.2/1.3 углеродпа сӑрланӑ пӑхӑр сетка ҫине (Agar Scientific, UK) янӑ. Сеткӑна 20°C тата 60% относительнӑй нӳрлӗхре 30 ҫеккунт хушши инкубацилемелле, унтан ӑна 3 ҫеккунт хушши типӗтмелле, унтан -176°C температурӑллӑ шӗвек этанра сӳнтермелле.
RC-LH114-W комплексӗн даннӑйӗсене eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) ҫинче Titan Krios микроскоппа ҫырса илнӗ, вӑл 300 кВ хӑвӑртлатмалли напряженипе ӗҫлет, унӑн номиналлӑ пысӑклатӑвӗ 130 000× тата энергипе Choo-se 200 кВ хушӑк пур. Даннӑйсене пухма шутлав режимӗнче ӳкерчӗксем ҫырса илме Gatan 968 GIF Quantum K2 пик детекторӗпе усӑ курнӑ. Калибрланӑ пиксель калӑпӑшӗ 1,048Å, доза хӑвӑртлӑхӗ 3,83 e-Å-2s-1. Фильма 11 ҫеккунтра пухса 40 пая уйӑртӑм. Микроскопа ҫӗнӗрен фокуслама углеродпа витнӗ лаптӑкпа усӑ курӑр, унтан кашни шӑтӑкра виҫӗ пленка пуҫтарӑр. Пурӗ 3130 фильм пухнӑ, вӗсен дефокус хакӗсем -1 тата -3 мкм хушшинче пулнӑ.
RC-LH116 комплексӗн даннӑйӗсене ҫав микроскоппа усӑ курса Астербери биоструктура лабораторийӗнче (Лидс университетӗ, Великобритани) пухнӑ. Даннӑйсене шутлав режимӗнче 130 к пысӑклатса пухнӑ, пиксель калӑпӑшне 1,065 Å таран 4,6 e-Å-2s-1 дозӑпа калибровка тунӑ. Фильма 12 ҫеккунтра ҫырса илнӗ, ӑна 48 пая уйӑрнӑ. Пурӗ 3359 пленка пухнӑ, вӗсен дефокус хакӗсем -1 тата -3 мкм хушшинче пулнӑ.
Пур даннӑйсене те Relion 3.0 конвейерӗнче (42) пурнӑҫлаҫҫӗ. Motioncorr 2 (43) программӑпа усӑ курса пайӑрка куҫӑмне доза виҫипе тӳрлетмелле, унтан CTFFIND 4.1 (44) программӑпа усӑ курса CTF (контраст куҫармалли функци) параметрне палӑртмалла. Ҫак малтанхи тапхӑрсем хыҫҫӑнхи типлӑ фотомикрографисене 2-мӗш ӳкерчӗкре кӑтартнӑ. S16. Автоматла суйласа илмелли шаблон 250 пиксельлӗ кадрта тата икӗ виҫеллӗ (2D) классификацисӗр 1000 пайӑркаран 250 пиксельне алӑпа суйласа илсе генерированиленет, ҫапла вара тӗслӗхсен вараланӑвне тивӗҫтерекен е палӑрмаллах паллӑсем ҫук классификацисене сирсе яраҫҫӗ. Унтан пур микрофотографисем ҫинче те автоматла суйласа илнӗ, RC-LH114-W 849 359 пайӑрка, RC-LH116 комплексӗ 476 547 пайӑрка пулнӑ. Пур суйласа илнӗ пайӑркасем те икӗ хутчен 2D классификацие тӗрӗс мар классификациленӗ, кашни тапхӑр хыҫҫӑн углерод лаптӑкне тивӗҫтерекен пайӑркасене, пробӑна вараланине, паллӑ паллӑсем ҫуккине е вӑйлӑн пӗр-пӗринпе ҫыхӑнса тӑракан пайӑркасене сирсе янӑ, ҫавна май 3D классификаци валли 772 033 (90,9%) тата 359 678 (75,5%) пайӑрка усӑ курнӑ. RC-LH114-W тата RC-LH116 ҫавӑн пекех. Малтанхи 3D-эталонлӑ моделе стохастика градиентлӑ анӑҫ мелӗпе усӑ курса тунӑ. Малтанхи модельпе усӑ курса, суйласа илнӗ пайӑркасене 3D форматпа тӑватӑ категорие уйӑрнӑ. Ҫак категорири модельпе усӑ курса, чи пысӑк категорири пайӑркасем ҫинче 3D рафинировани тумалла, унтан ирӗлтерекен лаптӑка хуплама малтанхи 15Å низкочастотнӑй фильтрпа усӑ курмалла, 6 пиксель ҫемҫе хӗррисем хушмалла, ҫӳлти детекторӑн Gatan K2 пик модуляци куҫармалли функцине тӳрлетме пиксельсене хыҫҫӑн ӗҫлесе хатӗрлемелле. RC-LH114-W даннӑйсен пуххи валли ҫак малтанхи моделе маска хӗррисенчи вӑйлӑ ҫӑра тӑвӑрлӑха кӑларса пӑрахса улӑштарнӑ (UCSF Chimera-ри тӗп комплекс ҫирӗплӗхӗнчен уйӑрнӑ). Ҫакӑн хыҫҫӑн пулса тухнӑ модельсене (RC-LH114-W тата RC-LH116 уйӑрӑмлӑхӗсем 3,91 тата 4,16 Å) 3D классификацин иккӗмӗш турӗ валли танлаштару вырӑнне усӑ кураҫҫӗ. Усӑ курнӑ пайӑркасене малтанхи 3D класа ушкӑнланӑ, вӗсен кӳршӗлӗхпе ҫирӗп ҫыхӑну ҫук. Пӗр-пӗринпе ҫыхӑнса тӑни е паллӑ структурӑллӑ паллӑсем ҫукки. 3D классификацин иккӗмӗш турӗ хыҫҫӑн чи пысӑк уйрӑмлӑхлӑ категорие суйласа илнӗ [RC-LH114-W валли пӗр категори — 377 703 пайӑрка (44,5%), RC-LH116 валли икӗ категори пур, пурӗ 260 752 пайӑрка (54,7% Wt), вӗсем хыҫҫӑн пӗр пек чухне кӑна ҫутатаҫҫӗ. малтанхи ҫаврӑну пӗчӗк уйрӑмлӑхпа]. Суйласа илнӗ пайӑркасене 400 пиксельлӗ ещӗкре тепӗр хут кӑлараҫҫӗ те 3D рафинировани мелӗпе тасатаҫҫӗ. Ирӗлтерекен маскӑна малтанхи 15Å низкочастотнӑй фильтрпа, 3 пиксельлӗ карттӑ сарӑлӑвӗпе тата 3 пиксельлӗ ҫемҫе маскӑпа усӑ курса тунӑ. Кашни утӑм хыҫҫӑн кашни утӑм хыҫҫӑн CTF ҫивӗчлӗхӗпе, пӗр пайӑрка куҫӑмне тӳрлетессипе тата кашни пайӑрка ҫине CTF ҫивӗчлӗхӗн иккӗмӗш турӗпе усӑ курса, 3D ҫивӗчлӗх, ирӗлтерекен маскировка тата хыҫҫӑнхи ӗҫлесе хатӗрлеҫҫӗ, ҫапла майпа пулса тухнӑ текстурӑна татах та ҫивӗчлетеҫҫӗ. FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) 0,143 чикӗ хакӗпе усӑ курса RC-LH114-W тата RC-LH116 юлашки модельсен уйрӑмлӑхӗсем 2,65 тата 2,80Å пулаҫҫӗ. Юлашки модельӗн FSC йӗрне 2-мӗш ӳкерчӗкре кӑтартнӑ. S17.
Пур белок йӗркисене те UniProtKB-ран илнӗ: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Белок-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) меслечӗпе усӑ курса RC гомологи моделӗ тунӑ, унта RC-L, RC-M тата RC-H белок йӗркисем тата Rba кристалл структури пур. sphaeroides RC шаблон вырӑнне усӑ курнӑ (PDB ID: 5LSE) (46). UCSF Chimera-ри «fit map» хатӗрпе усӑ курса генерациленӗ моделе карттӑпа (47) ҫыхӑнтарӑр, белок структурине лайӑхлатӑр тата кофактор [4×BChl a (мономер библиотекин юлашки ячӗ = BCL), 2×BPh a (BPH), пӗр е икӗ тӗрлӗ UQ10 (U10), пӗр гем мар тимӗр (Fe) тата пӗр гексадингидробон (QAK)] хушма Coot (48) усӑ курӑр. QAK мономер библиотекинче ҫуккине кура ӑна PHENIX-ри eLBOW инструментпа усӑ курса параметризациленӗ (49).
Унтан LH1 субединици тунӑ. Малтанах PHENIX-ри (49) автоматла строительство хатӗрӗпе усӑ курса LH1 йӗркин пӗр пайне карттӑпа тата LH1-α тата LH1-β белок йӗркисемпе усӑ курса автоматла майпа тунӑ. Чи тулли LH1 субединицине суйласа илӗр, ӑна кӑларӑр та Coot-а лартӑр, унта ҫитмен йӗркене алӑпа хушӑр, икӗ BCls a (BCL) тата спириллоксантин (CRT) хушиччен пӗтӗм структурӑна алӑпа лайӑхлатӑр [LH1 комплексӗн ҫӑра тӑвӑрлӑхӗ тата паллӑ каротиноид содержанийӗ тӑрӑх. Тӗс (17)]. LH1 субединицине пӗтӗмпех копилесе илӗр те UCSF Chimera «Docking Map Tool» хатӗрӗпе усӑ курса LH1 ҫӑраланӑвӗн ҫывӑхри модель мар лаптӑкне ҫыхӑнтарӑр, унтан ӑна Coot-ра лайӑхлатӑр; пур LH1 субединицисене те моделлесе пӗтериччен ҫак процеса тепӗр хут тумалла. RC-LH114-W структури валли, Coot-ра уйӑрман тыткӑнлӑха кӑларса, белок USCF Chimera карттинчи ытти белок мар компонентсенчен сегментланать те малтанхи моделе йӗркелеме Autobuild хатӗрӗпе усӑ курать, ытти субединицисене (protein-W) моделировани тӑваҫҫӗ. ФЕНИКСра (49). Coot (48)-ри результатлӑ модель ҫумне ҫитмен йӗркесене хушӑр, унтан пӗтӗм субединицӑна алӑпа лайӑхлатӑр. Ытти уйӑрман ҫӑра липидсен (PDB мономер библиотекин ID CDL = CDL, POPC = 6PL тата POPG = PGT), β-DDM детергенчӗ (LMT) тата UQ10 молекулисен (U10) комбинацийӗпе килӗшсе тӑрать. PHENIX оптимизацийӗпе (49) тата Coot-ра (48) алӑпа оптимизациленипе усӑ курса, модель статистикине тата ҫыхӑну пахалӑхне малалла лайӑхлатма май киличчен тулли пуҫламӑш моделе лайӑхлатма пулать. Юлашкинчен, вырӑнти карттӑна ҫивӗчлетме LocScale (50) меслечӗпе усӑ курӑр, унтан уйӑрман тыткӑнлӑха тата автоматла тата алӑпа оптимизацилемелли ытти темиҫе цикла пурнӑҫлӑр.
Тивӗҫлӗ пептидсене, кофакторсене тата ытти липидсемпе хинонсене хӑйсен ҫӑра шайӗнче ҫыхӑнтарнине 1 тата 2 ӳкерчӗксенче кӑтартнӑ. S18-ран пуҫласа S23 таран. Юлашки модель статистика информацине S1 таблицӑра кӑтартнӑ.
Урӑхла палӑртман пулсан, УФ/Вис/НИР абсорбци спектрӗсене Cary60 спектрофотометр ҫинче (Agilent, АПШ) 250 нм-ран пуҫласа 1000 нм таран 1 нм хушӑра тата 0,1 с интеграци вӑхӑчӗпе пухнӑ.
Пробӑна кварц кюветинче 2 мм ҫулпа A880 1 таран ирӗлтермелле те 400 тата 1000 нм хушшинчи абсорбци спектрне пухмалла. Ҫаврашка дихро спектрӗсене Jasco 810 спектрополяриметрпа (Jasco, Япони) 1 нм хушшинче 400 нм тата 950 нм хушшинче 20 нм мин-1 сканер хӑвӑртлӑхӗпе пухнӑ.
Молярлӑ экстинкци коэффициентне тӗп комплекса 50 яхӑн А880 таран ирӗлтерсе палӑртаҫҫӗ. 10 мкл калӑпӑша 990 мкл ҫыхӑну буферӗпе е метанолпа ирӗлтермелле те, BChl ҫӗмӗрӗлнине чакарма ҫийӗнчех абсорбци спектрне пухмалла. Кашни метанол пробинчи BChl содержанине 771 нм ҫинче 54,8 мМ-1 см-1 экстинкци коэффициенчӗпе шутласа кӑларнӑ, экстинци коэффициентне палӑртнӑ (51). Виҫнӗ BChl концентрацине 32 (RC-LH114-W) е 36 (RC-LH116) ҫине пайласа тӗп комплекс концентрацине палӑртмалла, унпа вара буферлӑ Extinction коэффициентӗнче пухнӑ ҫав пробӑн абсорбци спектрне палӑртма усӑ курмалла. параллельлӗ. Кашни проба валли виҫӗ хутчен виҫнӗ, шутлама BChl Qy максимумӗн вӑтам абсорбцине усӑ курнӑ. 878 нм ҫинче виҫнӗ RC-LH114-W экстинкци коэффициенчӗ 3280±140 мМ-1 см-1, 880 нм ҫинче виҫнӗ RC-LH116 экстинкци коэффициенчӗ вара 3800±30 мМ-1 см-1.
UQ10 (52)-ри меслетпе виҫнӗ. Кӗскен каласан, Agilent 1200 ВЭЖХ системипе усӑ курса каялла ҫаврӑнакан фазӑллӑ ВЭЖХ (РП-ВЭЖХ) тунӑ. 0,02 нмоль яхӑн RC-LH116 е RC-LH114-W 50 мкл 50:50 метанол:хлороформра 0,02% (в/т) тимӗр хлоридӗ хушса ирӗлтермелле те малтанах шайлаштарнӑ Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4 мм 1-1-мин ирӗлтермелле. 40°C ВЭЖХ ирӗлтерекенӗнче (80:20 метанол:2-пропанол) ×25 см колонкӑра. 275 нм (UQ10), 450 нм (каротиноидсем) тата 780 нм (BChl) ҫинче 1 сехет хушши абсорбцие сӑнаса тӑма ВЭЖХ ирӗлтерекенӗнче изократлӑ элюци тумалла. 275 нм хроматограммӑри 25,5 минутри пике интеграциленӗ, унта ытти тупма май пур хутӑшсем пулман. Интеграциленӗ лаптӑкпа 0-ран пуҫласа 5,8 нмоль таран таса эталонсене янӑ чухне шутласа кӑларнӑ калибровка йӗрӗ тӑрӑх экстракциленӗ UQ10 молярлӑ виҫине шутлама усӑ кураҫҫӗ (S14 ӳкерчӗк). Кашни тӗслӗхе виҫӗ хутчен тишкернӗ, пӗлтернӗ йӑнӑш вӑтам SD-па пӗр килет.
RC-LH1 комплекслӑ ирӗлчӗке 0,1 чи пысӑк Qy йышӑнӑвӗпе 30 мкМ чакарнӑ лаша чӗрин цитохромӗ c2 (Merck, UK) тата 0-50 μMUQ2 (Merck, UK) хатӗрленӗ. Кашни UQ2 концентрацийӗпе виҫӗ 1 мл проба хатӗрленӗ те виҫес умӗн тӗттӗме пӗтӗмпех хӑнӑхма 4°C температурӑра тӗттӗмре ҫӗр каҫа инкубациленӗ. Раствора OLIS RSM1000 модульлӗ спектрофотометра 300 нм ҫулӑм/500 йӗр решеткипе, 1,24 мм кӗмелли, 0,12 мм вӑтам тата 0,6 мм тухмалли шӑтӑксемпе тивӗҫтернӗ. 600 нм тӑршшӗллӗ фильтра проба фототрубкипе эталонлӑ фотоумножитель трубки кӗнӗ ҫӗре хумхантаракан ҫутта сирсе яма вырнаҫтарнӑ. Абсорбцие 550 нм ҫинче 0,15 с интеграци вӑхӑчӗпе сӑнанӑ. Ҫутӑ 880 нм M880F2 светодиодран (Thorlabs Ltd., UK) DC2200 контроллер урлӑ 90% хӑватлӑ оптика кабелӗ урлӑ (Thorlabs Ltd., UK) ҫутӑ ҫӑлкуҫӗ патне 90° кӗтеспе тухать. Виҫев пайӑрки тӗкӗр ҫумне хирӗҫ тӑрать, вӑл ҫутта каялла тавӑрса парать, ӑна малтан тӗслӗх йышӑнман. Ҫутӑ 50 ҫеккунт маларах 10 ҫеккунт маларах абсорбцие сӑнаса тӑрӑр. Унтан абсорбцие тӗттӗмре 60 ҫеккунт хушши малалла сӑнаса тӑнӑ, ҫапла майпа хинолол хӑй тӗллӗн цитохром c23 + мӗн таран чакарнине хакланӑ (чӗрӗ даннӑйсемшӗн S8 ӳкерчӗке пӑхӑр).
Даннӑйсене 0,5-10 ҫеккунтра (UQ2 концентрацийӗнчен килет) линейнӑй пуҫламӑш хӑвӑртлӑха лартса тата кашни UQ2 концентрацийӗнче виҫӗ пробӑн хӑвӑртлӑхне вӑтамлатса ӗҫленӗ. RC-LH1 концентрацине тивӗҫлӗ экстинкци коэффициенчӗпе шутласа кӑларнӑ, ӑна хӑвӑртлӑха каталитикӑлла эффективлӑха куҫарма усӑ курнӑ, ӑна Origin Pro 2019 (OriginLab, USA) программӑра ӳкернӗ, ӑна Michaelis-Menten моделӗ ҫине лартнӑ, ҫапла майпа курӑнакан Km тата Kcat хакӗсене палӑртнӑ.
Вӑхӑтлӑх абсорбци виҫисем валли RC-LH1 пробине 50 мМ натри аскорбатӗ (Merck, USA) тата 0,4 мМ Тербутин (Merck, USA) хушнӑ IMAC буферӗнче ~2 мкМ таран ирӗлтернӗ. Аскорбин кислотине парне электронӗн донорӗ пек усӑ кураҫҫӗ, трет-бутаклофена вара QB ингибиторӗ пек усӑ кураҫҫӗ, ҫапла вара виҫев процесӗ тӑршшӗпех тӗп RC донорӗ чакса (урӑхла каласан, фотоокисленмен) юлать. Лазер ҫулӗ ҫинчи проба хумхантару импульсӗсем хушшинче тӗттӗм адаптаци валли ҫителӗклӗ вӑхӑт пултӑр тесе 2 мм оптика ҫулӗллӗ ятарлӑ ҫаврӑнакан ячейкӑна (диаметрӗ 0,1 м яхӑн, 350 об/мин) 3 мл яхӑн пробӑна хушса хураҫҫӗ. Ti: Sapphire лазер системине (Spectra Physics, USA) вӑйлатма ~100-fs лазер импульсӗсемпе усӑ курса 880 нм ҫинче 1 кГц (NIR валли 20 нДж е Vis валли 100 нДж) пробӑна хумхантармалла. Даннӑйсене пухиччен пробӑна 30 минута яхӑн хумхану ҫутинче тытмалла. Экспозици QA инактивацине кӑларса тӑратӗ (тен, QA пӗрре е икӗ хутчен чакать). Анчах та ҫакна асра тытӑр: ку процесс каялла таврӑнать, мӗншӗн тесен тӗттӗмре нумай вӑхӑт хушши адаптациленнӗ хыҫҫӑн RC майӗпен QA ӗҫне таврӑнать. -10-ран пуҫласа 7000 пс таран вӑхӑтлӑх вӑхӑтлӑх спектрсене виҫме Helios спектрометрпа (Ultrafast Systems, USA) усӑ курнӑ. Surface Xplorer программипе (Ultrafast Systems, АПШ) усӑ курса даннӑйсен пуххисене уйӑрӑр, унтан пӗрлештерӗр те стандартизацилӗр. CarpetView программӑллӑ пакетпа (Light Conversion Ltd., Lithuania) усӑ курса пӗрлештернӗ даннӑйсен пуххипе усӑ курса ҫӗрӗшӳпе ҫыхӑннӑ дифференциаллӑ спектрсем илӗр е Origin (OriginLab, USA) программӑри пӗр хум тӑршшӗллӗ спектр эволюцине тивӗҫтерме инструмент хуравӗпе нумай экспонента пӗрлештерекен функципе усӑ курӑр.
Ҫӳлте асӑннӑ пекех (53), RC тата перифериллӗ LH2 антенна ҫук LH1 комплекслӑ фотосинтез пленки хатӗрленӗ. Мембранӑна 20 мМ триспа (рН 8,0) ирӗлтернӗ те 2 мм оптика ҫулӗпе кварц кюветине лартнӑ. 30нДж лазер импульсӗпе усӑ курса 540 нм ҫинче -10-ран пуҫласа 7000 пс таран кая юлса пробӑна хумхантарнӑ. Rps валли ҫырса кӑтартнӑ пек даннӑйсен пуххине ӗҫлесе хатӗрлерӗр. юлташ тӗслӗхӗ.
Мембранӑна 150 пин RCF температурӑра 4°C температурӑра 2 сехет хушши центрифугӑласа пеллетланӑ, унтан унӑн 880 нм ҫинче абсорбцине 20 мМ tris-HCl (рН 8,0) тата 200 мМ NaCl ҫинче ҫӗнӗрен суспендированнӑ. Мембранӑна 2% (w/v) β-DDM 1 сехет хушши 4°C температурӑра тӗттӗмре майӗпен пӑтратса ирӗлтермелле. Пробӑна 100 мМ триэтиламмоний карбонатӗпе (рН 8,0) (TEAB; Merck, UK) 2,5 мг мл-1 белок концентрацийӗ таран ирӗлтернӗ (Bio-Rad анализ). Малалла ӗҫлесе хатӗрлессине маларах пичетленнӗ меслетпе (54) туса пынӑ, 50 мкг белок 50 мкл TEAB-а 1% (в/т) натрий лаурачӗ (Merck, UK) хушса ирӗлтернинчен пуҫланӑ. ҫеккунт хушши ультрасасӑпа ӗҫленӗ хыҫҫӑн ӑна 5 мМ трис(2-карбоксиэтил)фосфинпа (Merck, UK) 37°C температурӑра 30 минут хушши чакарнӑ. S-алкилировани валли пробӑна 10 мМ метил S-метилтиометансульфонатпа (Merck, UK) инкубацилемелле те ӑна 200 мМ изопропанол ирӗлчӗкӗнчен пӳлӗм температуринче 10 минут хушши хушмалла. Протеолитлӑ ирӗлтерӗве 2 мкг трипсин/эндопротеиназа Lys-C хутӑшӗ (Promega UK) хушса 37°C температурӑра 3 сехет хушши инкубациленӗ. Лаурат ҫиелти активлӑ япалана 50 мкл этилацетат тата 10 мкл 10% (v/v) LC сортлӑ трифторуксус кислоти (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) хушса 60 с хушши ҫавӑрса илсе экстракциленӗ. Фазӑсене уйӑрма 15 700 RCF 5 минут хушши центрифугӑласа пулӑшнӑ. Производитель протоколӗпе килӗшӳллӗн, пептидлӑ аялти фазӑна асӑрханса аспирацилеме тата тӑварсӑрлатма C18 спин-колонкӑпа (Thermo Fisher Scientific, UK) усӑ курнӑ. Вакуумлӑ центрифугӑпа типӗтнӗ хыҫҫӑн пробӑна 0,5% ТЖК тата 3% ацетонитрил ҫинче ирӗлтернӗ, 500 нг вара маларах тӗплӗн ҫырса кӑтартнӑ системӑн параметрӗсемпе усӑ курса нанофотоклӑ РП хроматографипе тата масс-спектрометрипе анализланӑ.
Rps шырама белоксене палӑртма тата виҫме MaxQuant v.1.5.3.30 (56) программӑпа усӑ курӑр. palustris протеом базине (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Масс-спектрометри протеомикин даннӑйӗсене ProteomeXchange альянсне PRIDE партнерсен репозиторийӗ урлӑ (http://proteomecentral.proteomexchange.org) PXD020402 даннӑйсен пуххин идентификаторӗпе упранӑ.
Электроспрей ионизаци масс-спектрометрипе пӗрле RPLC мелӗпе анализ тума RC-LH1 комплекса тискер йышши Rps-ран хатӗрленӗ. Маларах пичетленнӗ меслетпе (16) усӑ курса, палустрис клеткисенче 20 мМ Hepes (рН 7,8), 100 мМ NaCl тата 0,03% (w/v) β- (Bio-Rad анализ) ) DDM-ра 2 мг мл-1 туса кӑларнӑ белок концентрацийӗ пулнӑ. Производитель протоколӗпе килӗшӳллӗн, 2D тасатмалли наборпа (GE Healthcare, USA) усӑ курса 10 мкг белок ҫуса тасатмалли меслетпе кӑлармалла, унтан ҫуса тасатнӑ япалана 20 мкл 60% (v/v) кӑпӑк кислоти (FA), 20% (v/v) ацетонитрил тата 20% (v/v) шывра ирӗлтермелле. Пилӗк микролитра RPLC (Dionex RSLC) тата масс-спектрометрипе (Maxis UHR-TOF, Bruker) анализланӑ. 60°C тата 100 μlmin -1 температурӑра уйӑрма MabPac 1,2×100 мм колонкӑпа (Thermo Fisher Scientific, UK) усӑ курӑр, 85% (v / v) А ирӗлтерекен [0,1% (v / v) FA тата 0,02% (V/v) TFA шыв ирӗлчӗкӗ 85% Bv/v) ирӗлтерекен градиентпа усӑ курӑр [0,1%(v/v) FA тата 0,02%(v/v) 90%(v/v) ацетонитрил TFA-ра] Стандартлӑ электроспрей ионизаци ҫӑлкуҫӗпе тата стандартлӑ параметрсемпе 60 минут ытла усӑ курса масс-спектрометр 100-2750 м/з (масса-заряд шайлашӑвӗ) илет. ExPASy биоинформатика ресурс порталӗн FindPept хатӗрӗпе (https://web.expasy.org/findpept/) массӑллӑ спектра комплексӑн субединицисем ҫине карттӑлӑр.
Клеткӑсене 100 мл NF-пӗчӗк (10 мкМм-2 с-1), вӑтам (30 мкМм-2 с-1) е пысӑк (300 мкМм-2 с-1) ҫутӑра 72 сехет хушши ӳстернӗ. М22 хутӑш (М22 хутӑш, унта аммиак сульфатне кӑларса пӑрахнӑ, натрий сукцинатне натрий ацетатӗпе улӑштарнӑ) 100 мл винтлӑ кӗленчере (23). Пилӗк 30-с циклра 0,1 микронлӑ кӗленче шӑрҫасене 1:1 калӑпӑш шайлашӑвӗпе шӑрҫаланӑ та клеткӑсене лизланӑ та пӑр ҫинче 5 минут сивӗтнӗ. Ирӗлмен япалана, татӑлман клеткӑсене тата кӗленче шӑрҫасене 16 пин RCF температурӑра 10 минут хушши сӗтел ҫинчи микроцентрифугӑра центрифугӑласа кӑларнӑ. Мембранӑна Ti 70.1 роторпа 100 000 RCF 20 мМ tris-HCl (рН 8.0) 40/15% (w/w) сахароза градиенчӗпе 10 сехет хушши уйӑрнӑ.
Пирӗн малтанхи ӗҫре ҫырса кӑтартнӑ пек, PufW ҫинчи His тегне иммунодетекцилесси (16). Кӗскен каласан, тасатнӑ ядро ​​комплексне (11,8 нМ) е мембрана, унта ҫавӑн пек концентрациллӗ RC (окисленипе палӑртнӑ, чакнӑ уйрӑмлӑх спектрне кӑларса пӑрахса тата сӑрланӑ гель ҫинчи нагрузкӑна танлаштарса палӑртнӑ) икӗ хутчен ирӗлтернӗ. Белоксене 12% бис-трис NuPage гель реплика ҫинче (Thermo Fisher Scientific, UK) уйӑрнӑ. RC-L субединицине лартма тата ӑна курма Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) геле сӑрланӑ. Иккӗмӗш гель ҫинчи белок иммуноанализ тума метанолпа активлӑ поливинилиденфторид (PVDF) мембрани ҫине (Thermo Fisher Scientific, UK) куҫарнӑ. ПВДФ мембранине 50 мМ tris-HCl (рН 7,6), 150 мМ NaCl, 0,2% (v / v) Tween-20 тата 5% (w / v) йӳҫӗтнӗ сӗт порошокӗнче блокланӑ, унтан анти-His тӗп антителапа (антитела ирӗлтернӗ буферта [50 мМ H/Hp 7,6), 150 мМ NaCl тата 0,05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, USA) 4 сехет хушши. Антитела буферӗнче 5 минут хушши 3 хут ҫуса тасатнӑ хыҫҫӑн мембранӑна хрен пероксидазипе (Sigma-Aldrich, UK) шӑшие хирӗҫле иккӗмӗш антитела (антитела буферӗнче 1:10 пин ирӗлтернӗ) пӗрлештернӗ. химилюминесценци субстрачӗ (Cyanagen, Итали) тата Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Великобритани).
Кашни сӑрланӑ гель е иммуноанализ йӗрӗн интенсивлӑх пайланӑвне ӳкерсе, пик айӗнчи лаптӑка пӗрлештерсе тата RC-L (сӑрланӑ гель) тата Protein-W (иммуноанализ) интенсивлӑх шайлашӑвне шутласа кӑларса, ImageJ (57) ӳкерчӗке ӗҫлесе хатӗрлесси. Ҫак шайлашусене моляр шайлашӑвӗсем ҫине куҫарнӑ, ҫакна шута илсе таса RC-LH114-W пробинче RC-L тата белок-W шайлашӑвӗ 1:1 пулнӑ тесе шутланӑ тата ҫавна май пӗтӗм даннӑйсен пуххине нормализациленӗ.
Ҫак статья валли хушма материалсем илме http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
Ку — Creative Commons Attribution License условийӗсемпе сарӑлнӑ уҫӑ доступлӑ статья. Статьяпа кирек мӗнле хатӗрпе те чикӗсӗр усӑ курма, сарма тата ҫӗнӗрен кӑларма ирӗк пур, анчах та унӑн малтанхи хайлавне тӗрӗс илсе кӑтартмалла.
Асӑрхаттару: Эпир сире хӑвӑрӑн электронлӑ почта адресне ҫеҫ ыйтатпӑр, ҫапла вара эсир страницӑна сӗнекен ҫын эсир электронлӑ почтӑна курасшӑн пулнине тата вӑл спам маррине пӗлтӗр. Эпир нимӗнле электронлӑ почта адресӗсене те ҫырса илместпӗр.
Ку ыйтупа эсир хӑна пулнине тӗрӗслеме тата спам автоматла ярса пама чарма усӑ кураҫҫӗ.
Дэвид Дж. К. Суэйнсбери, Парк Цянь, Филипп Дж. Джексон, Кейтлин М. Фарис, Дариуш М. Недзвиецки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Даниэль П. Каннифф, Марк Дж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристина Кирма, Эндрю Хитчер Хантер.
Реакци центрӗнчи ҫутӑ капкӑнӗн 1-мӗш комплексӗн пысӑк уйӑрӑмлӑ структури хинон динамикине ҫӗнӗлле ӑнланма май парать.
Дэвид Дж. К. Суэйнсбери, Парк Цянь, Филипп Дж. Джексон, Кейтлин М. Фарис, Дариуш М. Недзвиецки, Элизабет К. Мартин, Дэвид А. Фармер, Лорна А. Малоун, Ребекка Ф. Томпсон, Нил А. Рэнсон, Даниэль П. Каннифф, Марк Дж. Дикман, Дьюи Холтен, Кристина Кирма, Эндрю Хитчер Хантер.
Реакци центрӗнчи ҫутӑ капкӑнӗн 1-мӗш комплексӗн пысӑк уйӑрӑмлӑ структури хинон динамикине ҫӗнӗлле ӑнланма май парать.
©2021 Америка наукӑна аталантарас енӗпе ӗҫлекен ассоциацийӗ. пур правӑсем те сыхланса юлнӑ. AAAS — HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef тата COUNTER компанисен партнерӗ. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.